查看: 656|回复: 7

单细胞转录组+多组学31+,揭示肿瘤免疫抑制机制

[复制链接]

管理员

Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

主题
954
注册时间
2020.6.16
在线时间
501 小时

发表于 2022.11.30 10:36:57 | 显示全部楼层 |阅读模式
基于bulk RNA-seq+代谢组的关联策略,我们了解到转录调控可能影响下游代谢产物变化;反之,代谢物丰度存在间接影响转录调控的可能。基于转录组和代谢组共同富集到的通路信息,可分析通路内转录本和代谢产物之间的变化模式,寻找二者之间的关联。

而这一关联策略是否可应用于单细胞转录组+代谢组研究中呢?答案无疑是可行的,从今年1月在《Nature biotechnology》 发表的“Integrated analysis of plasma and single immune cells uncovers metabolic changes in individuals with COVID-19”文中可以了解到核酸修饰、脂质代谢、糖代谢及其调控基因与疾病严重程度显著相关,文章从代谢角度解析了代谢变化与新冠的关系。

对于肿瘤免疫研究,细胞的再分化过程对肿瘤进程的调控?分化过程中细胞群代谢重塑对分化过程的反馈?这些研究仍存在很大盲区。借助单细胞测序了解各类细胞亚群的分化进程,借助代谢组获得各类细胞亚群的代谢特征,可为此研究提供关联契机。

今天给大家分享的一篇 《Gut》 文章主要讲述的是:PDAC患者肿瘤相关中性粒细胞(TAN)中转录因子—BHLHE40高表达可诱导TANs向促癌亚群(TAN-1)分化,同时TAN-1伴随着糖代谢的高度活化,诱导TANs获得免疫抑制和促癌功能。作者是如何一步步发现,并层层验证的呢?留个悬念,一起来看看~


  • 发表期刊:Gut
  • 发表日期:2022年6月
  • IF:31.793

研究背景

胰腺癌主要由胰腺导管腺癌(PDAC)组成,是最致命的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡的主要原因之一。肿瘤相关中心粒细胞(TAN)的浸润与大多数恶性肿瘤的不良预后相关。先前,基于TCGA对列的转录组数据分析表明,相较于其他癌症类型,PDAC中的TAN浸润相对丰富,提示TAN在PDAC微环境的重要性。本文的主要目标是借助多组学技术,进一步揭示PDAC微环境对TAN的调控,以及TAN促癌机制。

实验设计

单细胞转录组:取2名健康对照组(HC)、2名慢性胰腺炎患者(CP)、5名PDAC患者外周血CD66b+外周血多形核白细胞(PMNs)和肿瘤组织中捕获浸润性中性粒细胞进行单细胞转录组测序;


验证队列1:24个PDAC患者外周血和肿瘤组织中收集成对的CD66+细胞进行转录组、蛋白质组、代谢组检测,用于验证单细胞数据分析的结论;
验证队列2:另外招募114例患者进行IHC、IF、空间转录组研究。


研究思路


研究结果

1. 单细胞转录组测序揭示促瘤亚群TANs-1是肿瘤微环境中中性粒细胞分化的终极状态,TANs-1与PDAC患者不良预后显著相关

组织形态学观察发现,PDAC组织中恶性细胞内部或邻近区域有大量TANs浸润,且中性粒细胞浸润较高的PDAC患者存在预后不良(图1A)。单细胞转录组从来自外周血的33,891个细胞和PDAC肿瘤组织的17,932个细胞中,共捕获96,692,883个unique transcripts。利用主成分分析、UMAP聚类和细胞marker genes注释,可将上述细胞分为9个细胞簇:中性粒细胞(两个clusters)、巨噬细胞、肥大细胞、B细胞、浆细胞、T细胞、导管细胞和成纤维细胞(图1B)。其中中性粒细胞1在外周血中强烈富集,而中性粒细胞2仅存在于肿瘤组织中(图1C)。t-SNE降维分析表明,TANs具有独特的RNA谱,而来自PDAC患者的PMN与来自健康对照或慢性胰腺炎患者的PMN较为相似(图1D),暗示中性粒细胞在募集到肿瘤组织后发生了显著的转录重编程,且该过程主要与细胞分化、先天免疫抑制、癌症相关信号激活和代谢通路有关(图1E)。

图1 外周血和PDAC肿瘤的单细胞图谱

*A:嗜中性粒细胞标记基因(CD66b)染色的代表性PDAC组织的IHC图像。左图中,恶性细胞形成的两个管状结构用橙色箭头突出,周围神经用绿色箭头突出;B:UMAP图描述来自健康对照组、慢性胰腺炎患者和PDAC患者外周血的CD66b+ PMN,以及来自PDAC肿瘤组织的CD45+免疫滤液的主要细胞类型;C:箱型图展示每个样品中鉴定的细胞类型;D:t-SNE降维分析可视化每个样本的中性粒细胞表达谱,TANs细胞表现出显著的转录重编程过程;E:点图显示PDAC患者TANs和PMN中典型的丰富的HALLMARK/ KEGG/ GO通路

为继续探索肿瘤微环境中,中性粒细胞和其它免疫细胞间的相互作用,作者借助细胞通讯分析,发现PDAC组织肿瘤微环境中,中性粒细胞与巨噬细胞之间存在密切的相互作用(图2A,B),该过程可通过CCL13-CCR1、CCL3-CCR1、CCL3L3-CCR1等轴完成(图2A)。GSEA富集分析表明,该过程伴随着TANs中TNFα/核因子kB(NF-kB)和IL-1信号通路显著激活(图2C)。IF染色实验与qPCR结果证实了GSEA分析结果的可靠性。基于此,作者得出肿瘤微环境中,中性粒细胞和巨噬细胞之间存在密切的串扰

图2 PDAC微环境中中性粒细胞和其他细胞之间的细胞间通讯

*A:点图描绘PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞和其他细胞之间的配体-受体相互作用;B:柱状图描述了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞和其他细胞之间重要的配体-受体相互作用的数量;C:GSEA显示TANs中TNFα和IL- 1通路的富集分数

PDAC肿瘤中TANs是否存在异质性?PDAC患者的PMN和TANs单细胞数据UMAP分析,发现PMN细胞,TANs细胞均可再细化为6个细胞亚群(图3A,B),亚群相关性分析指示,TAN细胞亚群间的差异性更大,提示肿瘤浸润性中性粒细胞是一个异质性群体(图3C)。对TANs亚群进行细胞注释和拟时分析,结果发现中性粒细胞分化轨迹是以PMN为起点,经过刚刚迁移到肿瘤微环境的过渡期中性粒细胞亚群(TAN-3)进入到TAN状态,随后过渡到TAN-0和高表达干扰素刺激基因细胞亚群(TAN-4)的中间肿瘤浸润状态,最后到达炎症相关亚群(TAN-2)和促癌亚群(TAN-1)的终极分化状态(图3D,E)。

图3 来自PDAC肿瘤的TANs是由一个异质群体组成

*A-B:UMAP分析显示PDAC患者的PMNs亚群和TANs亚群;C:不同亚群的相关性分析;D:marker基因注释不同类型的TANs亚群;E:拟时分析揭示肿瘤微环境中中性粒细胞的分化轨迹

在整个分化过程中1757个基因丰度存在显著失调,其表达模式分别为:1.随着分化轨迹持续下调表达的基因,该类基因主要与IFN信号通路和先天免疫功能相关;2.在肿瘤浸润早期上调表达,主要参与吞噬和抗原呈递过程;3.在肿瘤微环境晚期被激活,主要在缺氧、内质网应激、IL-1和TNF信号通路及糖酵解途径中富集(图4A)。用内质网应激诱导剂THG、促炎因子IL-1β和tnf-α处理中性粒细胞样HL-60细胞(dHL-60),THG和缺氧均可导致TAN-1标记基因显著上调表达,暗示内质网应激和缺氧是TAN-1极化的有效刺激因子(图4B)。临床数据分析显示,TAN-1标记基因VEGFA与PDAC患者晚期和不良预后显著相关(图4C,D)。

图4 PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞分化过程中基因丰度变化特征以及TAN-1与临床PDAC患者预后相关性

*A:中性粒细胞分化过程中3种基因丰度变化模式;B:qPCR分析THG、IL- 1β、TNFα和缺氧刺激中性粒细胞样dHL- 60细胞24小时后TAN- 1标记基因的表达;C:Kaplan- Meier生存曲线在免疫组化分析中显示PDAC患者的总体生存期;D:箱型图描述早期疾病(AJCC分期≤IIA)和晚期疾病(AJCC分期≥IIB)患者PDAC组织中,VEGFA+ TANs、NLRP3+ TANs、MME+ TANs和IFIT2+ TANs在细胞总数中的百分比

基于上述单细胞的数据,我们可以了解到中性粒细胞在募集到肿瘤组织后,从PMN状态沿着TAN-3→TAN-0,TAN-4→TAN-1,TAN-2过程分化,形成促癌细胞并与巨噬细胞相互串扰,且在整个分化过程中发生了显著的转录重编过程,主要表现出先天免疫抑制、癌症相关信号激活、代谢通路异常、缺氧和内质网应激过程,同时锁定到TAN-1亚群是促癌关键亚群。

2. 代谢特征分析表明,糖酵解在中性粒细胞转化过程中被激活,使中性粒细胞获得免疫抑制和促癌功能

TAN-1亚群代谢过程是否受到变化?代谢过程的异常表达是否对免疫抑制有调控作用?后续作者对每个TANs亚群开展代谢特征分析。发现,相比于其他中性粒细胞TAN亚簇,TAN-1的糖酵解和缺氧活性显著升高,并沿着中性粒细胞分化轨迹逐渐上调表达(图5A,B)。根据TAN-1 marker基因LGALS3分离出TAN-1中性粒细胞,其中葡萄糖转运体GLUT1、糖酵解酶HK2、PFKFB3、LDHA上调表达(图5C)。PDAC组织切片空间转录组结果以及从19例PDAC患者中分离出配对的PMN、TANs的转录组、蛋白质组、代谢组结果再次证明了TANs中糖酵解活性被激活(图5F-H)。代谢组数据显示,相比于PMNs,糖酵解通路中的糖类代谢物在TANs中显著增加(图5I)。

图5 代谢分析显示糖酵解在TAN-1中被激活

*A:糖酵解和缺氧标记在每个TANs亚群中的表达量热图;B:糖酵解(Glycolysis)特征和缺氧(Hypoxia)特征延细胞分化轨迹动态表达;C:流式细胞术分析PDAC组织中LGALS3+和LGALS3−TANs中GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA的表达;D:肿瘤、邻近肿瘤和间质区中性粒细胞富集点的空间特征图;E:盒状图显示肿瘤、邻近肿瘤和间质区中性粒细胞富集点的糖酵解特征;F-G:转录组、蛋白质组GSEA分析显示HALLMARK糖酵解途径显著富集在TANs中;H:PMN和TAN裂解物中糖酵解中间体的代谢组学分析;I:糖酵解途径示意图。红色框表示与PDAC患者的pmn相比,TANs中的代谢物显著增加(p<0.05)

深入分析糖酵解激活对中性粒细胞功能的影响,作者在中性粒细胞样分化的HL-60(dHL-60)细胞中,过表达糖代谢的关键酶LDHA。体外实验揭示了LDHA过表达可激活dHL-60细胞糖代谢活性,并导致其获得免疫抑制和促癌功能。基于此,作者得出第二个结论:中性粒细胞在募集到肿瘤组织后,其TANs亚群中糖酵解途径被激活,使其向促癌功能发展

3. BHLHE40是中性粒细胞向TAN-1表型分化的关键调控因子

溯源上游转录因子对TANs亚群的调控作用,利用SCENIC分析,发现TAN-1标记基因之一BHLHE40是TAN-1中最显著上调表达的转录因子之一(图6A),根据SCENIC构成的基因调控网络,推测出BHLHE40是转录因子HIF1A和XBP1的下游靶基因,BHLHE40可调节TAN-1标记基因VEGFA、PLAU、 LGALS3、LDHA、BHLHE40 (自调控),以及TAN-2标记基因PDE4B、IL1RN的表达(图6B,C),提示肿瘤微环境中BHLHE40是中性粒细胞向TAN-1表型分化的关键调控因子。染色质免疫沉淀实验证实BHLHE40可与TAN-1标记基因启动子区域结合,直接发挥转录调控作用(图6E)。功能实验证实,在dHL-60细胞中过表达BHLHE40可激活其促癌和免疫抑制功能。PDAC的组织免疫组化分析也揭示了BHLHE40+中性粒细胞与不良预后有关(图6D)。

图6 上游调控因子分析发现BHLHE40是TAN-1的关键转录因子

*A:BHLHE40在TANs中表达的UMAP图;B:SCENIC分析揭示BHLHE40潜在调控网络;C:qPCR分析BHLHE40靶蛋白在对照组和BHLHE40过表达的dHL-60细胞中的表达;D:染色质免疫沉淀-qPCR分析dHL-60细胞中BHLHA40在靶基因启动子区域的结合;E:qPCR分析THG、HYP、THG+HYP刺激dHL-60细胞24h后BHLHE40靶细胞和BHLHE40敲除细胞的表达。

小结

该研究揭示了PDAC肿瘤微环境中TAN的异质性和促癌亚群,并阐述了诱导中性粒细胞转化为促癌亚群的分子机制,即在肿微环境中,中性粒细胞在BHLHE40转录因子的作用下,下游靶基因VEGFA、PLAU、 LGALS3、LDHA高表达,诱导其向促癌细胞亚群TAN(TAN-0、TAN-1、TAN-2、TAN-3、TAN-4)分化,在分化过程中由于缺氧和内质网应激,糖代谢解途径被激活再次促使中性粒细胞向促癌功能发展。促癌TAN亚群或中性粒细胞的代谢重编程可作为潜在的免疫治疗靶点,为开发新的针对中性粒细胞的免疫治疗提供了理论依据。

文章主体以单细胞数据挖掘为主,根据单细胞测序结果分析出肿瘤微环境中中性粒细胞仍存在异质性,可再细化成不同的细胞亚群。并借助拟时分析指示出中性粒细胞的分化轨迹,结合GSEA富集分析锁定到TANs亚群存在代谢重编程过程。同时,单细胞的数据直接给出促肿瘤细胞亚群TANs-1的代谢特征出现异常,为后续的转录组、蛋白质组、代谢组验证指明方向,也为后续的分子验证实验奠定基础


想做单细胞测序并进行多组学关联的老师,可以联系我们当地销售~基迪奥专业的生信分析团队和经验丰富的技术支持团队助力您更深入的挖掘单细胞数据,建立组学关联,多维度解析研究问题。

参考文献
Wang L, Liu Y, Dai Y, et al. Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment. Gut. 2022 Jun 10:gutjnl-2021-326070.


*未经许可,不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有,侵权必究。


本文作者:基迪奥-zero


本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
137 小时

发表于 2022.11.30 12:10:10 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2017.11.3
在线时间
351 小时

发表于 2022.12.1 07:58:44 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.2.12
在线时间
133 小时

发表于 2022.12.1 09:08:03 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2021.3.26
在线时间
25 小时

发表于 2022.12.1 09:36:25 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
137 小时

发表于 2022.12.1 10:58:56 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

中华鲟

Rank: 5Rank: 5

主题
0
注册时间
2016.5.10
在线时间
35 小时

发表于 2022.12.1 15:23:29 | 显示全部楼层
十二月开始
新的一天加油!
回复 支持 反对

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
137 小时

发表于 2022.12.2 15:21:23 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表