如何利用16S+转录组研究微生物与宿主互作关系

基迪奥-Jt桃

微生物群落研究，最根本的目的是找到疾病与健康、处理与对照......等表型差异的驱动因子，进而揭示相应的分子机制。为了达到这种目的，常通过①理化因素②生物分子实验③微生物数据④个性化分析⑤多组学关联分析（图1），这5种手段组合来进行数据挖掘。根据研究目的不同，上述五种要素可进行随意组合。根据研究目的不同，上述五种要素可进行随意组合，那如何合理搭配要素，以解决相关生物学问题呢？我们会以一系列的文章来说明。

海洋生物对气候变化的适应机制一直是海洋生命科学领域关注的热点。特别是牡蛎作为全球性的养殖贝类，其夏季规模性死亡问题一直是制约产业发展的世界性难题。今天这篇案例文章组合了①理化因素③微生物数据⑤多组学关联分析（16S+转录组）几种要素，从宿主—共生菌群同时出发，研究了环境胁迫下两者的变化趋势及相互作用机制。一起来看下吧......

宿主与共生菌群的相互作用对牡蛎适应夏季海水温度升高具有重要作用

• 合作单位：中国科学院海洋研究所
• 发表期刊：Environmental Research
• 影响因子：8.431
• 发表时间：202210
  

研究背景

海洋在气候调节方面发挥重要作用。1970年以来，海洋吸收了超过90%由温室效应带来的额外热量，这也导致了海洋温度的日益升高和剧烈波动，即海洋暖化。以海洋暖化为代表的气候变化对海洋生物有深远影响，特别是生活在潮间带和近岸水域无法自主迁移的牡蛎等贝类。牡蛎作为全球性的养殖贝类，其夏季规模死亡问题一直是制约产业发展的世界性难题。因此，研究牡蛎的夏季高温适应机制具有重要的科学和产业意义。

研究目的

海洋暖化不仅影响海洋动物自身的生理状态，同时对其体内的共生菌群产生影响，包括菌群结构与功能的改变。肠道菌群的失衡对宿主来说往往是致命性的。然而，宿主与共生菌群之间的相互作用对生物适应海洋暖化的作用机制尚没有完全解析。

研究材料

选择了二倍体和三倍体牡蛎，每个倍性选择300只，分别在6月-11月的持续监测和采样。试验期间每三十分钟记录一次水温，选取要死亡和日期温差较大的样本进行16S和转录组分析。

研究思路

组合要素：
微生物数据、理化因子数据、关联分析（16S+转录组）

研究结果

本研究中，同时描述了经历夏季死亡事件的二倍体和三倍体牡蛎的共生肠道菌群及转录响应，以研究1）温度在形成共生菌群中的作用；2）敏感和抗性牡蛎的不同菌群结构；3）牡蛎在温度升高引起的微生物群落变化的响应机制；4）细菌增殖与牡蛎抑制免疫功能之间的因果关系。

1. 环境因子研究

监测期间的水温如图1所示，平均海水温度从22.8℃下降到10.3℃。8月18日记录到最高温度27.9℃，从8月14日至8月21日每天的温差高于1.6℃，范围在1.67~2.64℃。

敏感牡蛎（二倍体）和抗性牡蛎（三倍体）的累积死亡率不同（p<0.0001，图1B）。敏感牡蛎死亡率在8月18日气温最高、波动最大时首次出现，9月达到峰值，9月22日以后趋于稳定。而抗性牡蛎，除9月22日外，其余的监测点死亡率都很低。敏感牡蛎的累积死亡率（46.7%）高于抗性牡蛎（17.3%）。这种死亡率差异，在牡蛎养殖行业中并不少见。

图1  6月23日至11月28日水温检测和牡蛎死亡率

2. 微生物数据

对肠道微生物测序得到的OTU进行聚类，被分为2组（图2）。一个聚类包含7、8月份的样本；另一个聚类包含6、10、11月份的样本。9月份的样本被分为2簇。敏感牡蛎和抗性牡蛎分别被纳入7-8月和6-10月的聚类。对所有样本进行PCoA分析（r=0.893，p=0.001），结果保持一致。表明不同月份间牡蛎的微生物群落结构存在较大差异。

图2  OTU聚类树及菌群PCoA分析

对不同倍性样本的α多样性指数进行研究（图3）。两个倍性的α多样性指数变化趋势相似。ACE和Chao1反映了丰富度，呈现先降低后升高的趋势。但反应多样性的Shannon和Simpson指数呈现先升高后降低的趋势。敏感牡蛎的ACE和Chao1在9-10月份和11月份缓慢增加，抗性牡蛎的ACE和Chao1在8-9月份迅速增加，并在10-11月份保持相同水平。9-10月，抗性牡蛎的菌群丰富度显著高于敏感牡蛎。这些差异可能与抗性牡蛎和敏感牡蛎之间的死亡率不同有关。肠道微生物群落的变化或失调是死亡前被观察到的特征，被认为是死亡的前兆。

图3 不同倍性及月份牡蛎的α多样性分析

对N209和N309的样本进行指示物种分析（LDA>4），门水平上，N209最具鉴别能力的biomarker是变形菌门(Proteobacteria)和酸性菌门(Acidobacteria)，N309最具鉴别能力的biomarker为厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门（Verrucomicrobiales）（图4）。

图4 敏感牡蛎和抗性牡蛎不同菌群的LEfSe分析

比较了N209、N309的biomarker在top10目中的变化情况（图5C和5D），聚类热图分为了两个亚群，其中亚群1的相对丰度先升高后降低，亚群2的相对丰度先降低后升高。在两者的拐点不同。不同益生菌和共生菌的差异变化，对牡蛎的生存和生长具有重要作用。

图5 敏感牡蛎和抗性牡蛎中top10目的相对丰度热图（红色字体为敏感牡蛎的biomarker，绿色字体为抗性牡蛎的biomarker）

3. 转录组数据

对敏感牡蛎和抗性牡蛎的转录组数据，进行DEseq分析，根据FDR<0.05和|log2FC| > 1的标准，共得到4545和4423个DEGs。除基因数量上的差异外，敏感牡蛎和抗性牡蛎之间的基因表达模式也存在差异（图6）。在聚类I中，8月份抗性牡蛎样品中与吞噬体和溶酶体相关的基因表达量较高，而在敏感牡蛎中未检测到明显的波动。因此也证实了抗性牡蛎诱导吞噬体和溶酶体的免疫功能，以应对温度升高引起的不利细菌增殖。与聚类I相反，来自受体相关的免疫途径的基因聚集在II中，敏感牡蛎中保持较高的表达水平。推测敏感牡蛎可以感知病原体，但免疫反应效率低，吞噬小体和溶酶体表达低。

图6 不同样本的免疫基因表达量热图

4. 关联分析（环境因子+微生物、微生物+转录组）

1）环境因子与微生物群落的相关性

图7A和7B分别为敏感牡蛎和抗性牡蛎中α多样性指数与环境因子的Spearman的相关性分析。海水温度（T）与丰富度指数（ACE、Chao1）呈负相关，与多样性指数（Shannon、Simpson）呈正相关。溶解氧（DO）和盐度（SAT）呈相反的变化趋势。温度与α多样性指数之间的相关性系数在敏感牡蛎中高于抗性牡蛎。

图7 环境因子与α多样性指数间的相关性分析

环境因子与敏感牡蛎和抗性牡蛎的top10菌门的相关性，结果分析，敏感牡蛎的相关系数高于抗性牡蛎（图8）。在两个倍性中，top10菌门的聚类模式均表现出温度依赖性。因此，温度是影响牡蛎肠道菌群形成的主要因素，且对敏感牡蛎肠道菌群的影响大于抗性牡蛎。

图8 环境因子与top10君们的相关性热图和聚类

2）细菌群落与宿主转录组的相关性分析

对转录组的DEGs基因与不同倍性牡蛎的差异物种进行相关性分析，结果发现抗性牡蛎中profile1和profile16富集基因的变化与四个重点目的变化趋势密切相关，拐点均在8月（图9）。在敏感牡蛎中，profile1和profile16的拐点出现在8月，早于重点目的9月和10月。在敏感牡蛎中，profile1与梭状芽孢杆菌和Verrucomicrobiales呈正相关，与酸杆菌属和Betaproteobacteriales负相关，而profile16与之呈现相反的趋势。梭状芽胞杆菌被认为是可以促进牡蛎生长的益生菌，而酸性菌和Betaproteobacteriales可能是对牡蛎不利的潜在病原体。这些结果表明，共生菌群在牡蛎适应升温过程中起着重要作用。

图9 差异基因与top10菌门的相关性热图

结论

在死亡高峰期，两种牡蛎的菌群组成和丰度差异显著，差异菌群分析发现抗性牡蛎内两种益生菌（Verrucomicrobiales、Clostridiales）显著富集，而敏感牡蛎中两种潜在病原菌（Betaproteobacteriales、Acidobacteriales）显著增加，这表明不同菌群结构对牡蛎适应高温胁迫产生的不同结果。在死亡高峰期前，抗性牡蛎菌群结构发生快速转变，体现在不利菌群丰度的减少与有益菌丰度的增加，说明了抗性牡蛎对共生菌群具有更强的调节能力。同时，基因表达与功能富集发现，抗性牡蛎中外源物清除、吞噬作用、溶菌酶等免疫功能显著增强，表明这些免疫功能会抑制温度引起的不利菌的扩增，以维持共生菌群的平衡与稳定。而敏感牡蛎不能有效调动这些免疫功能，无法应对温度引起的菌群变化，致使菌群结构失衡进而引发死亡。


本文点评

本研究从宿主-共生菌群互作的视角解析了牡蛎应对高温胁迫的适应机制，揭示了牡蛎抗病抗逆的关联机制。环境因子（T、DO、SAT）——抗性牡蛎、敏感牡蛎中菌群结构发生显著变化——牡蛎通过调动免疫机制应对环境的变化并维持肠道菌群的平衡。三者之间层层递进围绕主线展开研究。为海洋生物的高温适应机制提供了新的见解。同时也解答了三倍体牡蛎抗逆优势的内在机制，菌群与基因表达差异为牡蛎病害防控上提供了研究的思路，也为夏季牡蛎规模性死亡的问题解决提供了重要理论基础。

利用多种要素组合方式来构建文章的整体框架，使得研究内容更加翔实。也可参考以往的研究文章：
【微生物群落应用篇7】16S+宏基因组揭示群落物种和功能的共同响应机制
微生物群落经典思路解读-利用“16S+转录组”揭示溴氰菊酯对鲶鱼的毒性机制
微生物群落经典思路解读-利用多组学实现“因”、“果”型研究
【微生物群落应用篇3】小样本量的宏基因组也能发6分以上期刊SCI
【微生物群落应用篇2】如何发表IF=16+的高分16S文章
微生物群落应用篇之-16S+代谢关联

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本文作者：基迪奥-小安

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