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小样本量的宏基因组也能发6分以上期刊SCI

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发表于 2022.9.23 09:34:33 | 显示全部楼层 |阅读模式
微生物群落研究,最根本的目的是找到疾病与健康、处理与对照……等表型差异的驱动因子,进而揭示相应的分子机制。为了达到这种目的,常通过①理化因素②生物分子实验③微生物数据④个性化分析⑤多组学关联分析(图1),这5种手段组合来进行数据挖掘。

根据研究目的的不同,上述五种要素可进行随意组合,那如何合理搭配要素,以解决相关生物学问题呢?带着疑问,我们开启基迪奥群落应用的第三篇文章,探讨如何基于小样本量宏基因组研究小檗碱对断奶仔猪肠道菌群的影响。

图1 微生物群落的5种分析手段

(Front. Microbiol. 2022 IF=6.064)

实验背景

本研究旨在通过宏基因组研究补充小檗碱对断奶仔猪直肠微生物结构和功能的影响。

实验取材

将12只21日龄的断奶仔猪,随机分为对照组和小檗碱组(6个重复,1头猪/重复),分别饲喂在基础饲粮中添加0和0.1%小檗碱的饲粮,21d后取直肠粪便样本进行宏基因组测序。

要素组合策略

☑微生物数据

实验设计


实验结果

宏基因组的群路研究套路一般采取的是三部曲,即群落多样性分析,物种分析、功能富集分析。一般文章都会基于这三大板块,进行直线式的逻辑描述。

首先对群落αβ多样性分析后,我们能对样本和分组的整体菌群结构有个大致的了解;
再依据“整体到局部”的思路,详细探究样本和分组中到底是哪些物种的变化,进而驱动了整个菌群结构的差异,也就是所谓的物种分析;
以上的研究仅能告知这个群落中物种的变化情况,但这些物种到底是行驶了什么功能,最终才导致表型的差异,我们是不知道的,因此最后一般都会做功能富集分析,来更加全面的阐述分组差异机制。

本文也是这样的架构,那接下来就详细分析下作者是如何进行论证的。

1. 小檗碱对猪肠道菌群α多样性的影响

对于α多样性分析,本文用的是种水平数据,结果发现小檗碱组Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数均低于对照组(p<0.05)(图2)。

图2 对照组与小檗碱组α多样性分析
*A:Chao1;B:ACE;C:Shannon;D:Simpson

2. 小檗碱对猪肠道菌群β多样性的影响

对于小檗碱与对照组的β多样性分析,本文未用PCA/PCoA/NMD等降维散点图,而是通过Anosim组间统计检验,直观的给出处理与对照间菌群结构的差异程度(图3),结果发现两组属和种水平的菌群结构差异都是极显著的(p<0.01)。

图3 对照组与小檗碱组组间β多样分析
*A:属水平;B:种水平

3. 对照组和小檗碱组之间的指示物种分析

群落多样性分析只是基于样本或分组,从宏观层面给出处理效应是否会导致分组内物种的丰富度变化(α多样性),进而导致组间菌群相似性(β多样性)的差异。但具体物种是怎样变化的,处理后哪些丰度会升高,哪些会降低,群落多样性分析是无法给出答案的。因此接下来要做物种层面的研究,在群落中,物种分析一般分为物种组成和物种差异,前者是基于热图/堆叠图等,简单展示下组间或各个样本物种的分布情况,多用于优势物种,稀有物种的研究;后者是通过各种统计检验,给出物种在组间具体富集情况。而本文主要做的是差异分析,结论如下:

3.1 物种维恩分析

基于veen分析,对两组共有和特有物种的数量进行统计,结果发现在对照组和小檗碱组中,分别筛选到1314和525种特有微生物;而两组共有的微生物为3218种。

图4 对照组与小檗碱组间物种Venn分析

3.2 基于统计检验筛选差异物种

两组间的welch's t检验显示,添加小檗碱显著提高了Subdoligranulum variabile、约氏乳杆菌、Parabacteroides distasonis等丰度(p<0.05),显著降低了Prevotella copri,Prevotella sp.P2-180,Prevotella sp.P4-76等丰度(图5)。

图5 两组的welch's t检验

ANOVA检验进一步分析显示,与对照组相比,添加小檗碱显著提高了S.variile的丰度(p<0.05),但显著降低了p.copri的丰度(图6)。

图6 两组的方差分析

4. 对照组和小檗碱组之间的功能分析

最后就是功能富集分析,本研究主要通过CAZy和KEGG这两个数据库进行功能注释,这是因为有报道称小檗碱可以通过改善肠道菌群来激活一些信号通路和碳水化合物相关酶。因此作者就挑选KEGG综合性数据库和CAZy碳水化合物酶相关的专业数据库来进行表征,结论如下:

4.1 两组的CAZy功能分析

先把基因映射到CAZy数据库,得到功能的丰度表,基于此表再进行对照和小檗碱两组间的统计检验,结果发现,显著富集的通路主要包括糖苷水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)和辅助活性(图7),但小檗碱组的PL和CE水平均低于对照组。

图7 对照组与小檗碱组CAZy分析

4.2 两组的KEGG功能分析

KEGG的分析流程类似于CAZy,先对基因进行注释得到功能丰度,再进行统计检验,这里用到的是LEfSe分析,结果显示在小檗碱组中显著富集的通路包括碳水化合物代谢、环境信息加工、不同环境下的微生物代谢、药物代谢细胞色素P450等(图8)。

图8 对照组与小檗碱组KEGG分析

本文点评

①最后就是我们的文章点评环节,同样先以要素组合的角度来解析,作者为何仅仅基于“微生物数据”来论证这篇文章:任何手段技术,都是为研究目的来服务的,本文作者旨在研究补充小檗碱对猪直肠微生物结构和功能的影响。不同于第二篇群落应用文章给出的“肠道--抗生素--疾病”三个关键词,本文主要涉及“小檗碱添加--是否导致肠道菌群结构和功能变化”。那么,很明显要基于微生物数据来分析变化情况。这里有个小小的tips,就是作者为什么没有选择16S的微生物数据,而是做了宏基因组,也是从研究目的出发,作者想探讨的除了物种变化,还想知道功能的响应情况,而16S测的是小片段,无法得到全部基因组信息,因此只能借助PICRUSt2、Tax4Fun进行功能的预测,这远没有宏基因组的功能分析准确,因此一般涉及到功能研究,还是选宏基因组的性价比高。

②再来说说本文分析上的亮点。本文的样本数并不多,分析点也是常规的三部曲,但作者的思路非常清晰,既然要看小檗碱添加与否对肠道菌群的影响,那我就设置两个组:一个添加小檗碱,一个不加,然后只要分析群落多样性、物种、功能这些菌群指标是否有差异,就能揭示小檗碱的影响。因此作者通篇都只用了一种分析思想,就是组间的统计检验,并未有其他的累述,这也是一种很好的分析思路,可以借鉴!

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参考文献
Hu H, Xu K, Wang K, Zhang F, Bai X. Dissecting the Effect of Berberine on the Intestinal Microbiome in the Weaned Piglets by Metagenomic Sequencing. Front Microbiol. 2022 Apr 7;13:862882. doi: 10.3389/fmicb.2022.862882. PMID: 35464928; PMCID: PMC9021597.

*未经许可,不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有,侵权必究。


本文作者:基迪奥-潇潇

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