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【单细胞农学专题】非模式植物的细胞分化发育研究大盘点

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发表于 2022.9.21 09:33:03 | 显示全部楼层 |阅读模式
细胞分化是同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类型的过程,本质是基因组在时间和空间上的选择性表达,通过不同基因表达调控,最终产生标志性蛋白。基于上述概念,单细胞测序技术可以很好的解决细胞层面的基因表达调控研究,然而近些年使用单细胞测序技术研究模式生物的细胞分化发育已经层出不穷,但是由于非模式植物在实验和分析上的一些限制,使得很多老师望而却步。所以,本文重点盘点非模式植物的细胞分化发育研究的项目设计及分析思路,希望可以对你的研究提供帮助。

从下面5篇案例研究的分化发育问题中我们不难发现,它们有以下几个特点:

(1)测序材料都是以幼嫩的叶或茎为主。主要原因是新鲜幼嫩材料可以很容易的制备到原生质体,解决了植物单细胞测序数据质量不高的担忧。

(2)以幼嫩材料来研究分化发育是符合生物生长发育的正常逻辑。因为在植物幼嫩时期,正是植物快速分化发育的阶段,为项目设计、单细胞数据获取、分化发育研究提供一条简单、合理、线性的逻辑。

(3)单细胞测序技术应用在非模式植物上进行分化发育研究可以有很多创新点。因为以往研究都是用传统的生理学和分子生物学方法来研究植物发育,但是单细胞技术可以带来全新的单细胞视角,不仅可以为我们探索新的生物学发现,还可以验证传统方法的研究结果或假说。

(4)非模式植物的单细胞注释可以根据自己的研究目的和研究背景进行自定义的注释。通常来说非模式植物的细胞注释方法主要有3种,第一种是没有任何的研究基础,作者根据切片显微镜观察横断面结果进行细胞注释,这种观察的结果不仅可以为细胞注释提供明确的细胞类型,还可以明显的提高文章档次,因为这是第一篇研究该组织结构的单细胞文章。第二种是有前人的研究基础,但不多的情况。这种情况可以做切片来进一步观察组织结构,利用这个结果不仅可以验证前人的研究结果,还可以有新发现,但切片方法还是很繁琐和复杂;这时候还可以根据前人的研究基础和该项目的研究目的结合,只注释感兴趣和后续研究的细胞类型,其他不明确亚群可以简单分析即可。第三种是研究基础比较多的情况,这种可以直接使用转录组数据或者marker基因来对细胞进行全面注释,近似于模式植物的研究,可以参考拟南芥或水稻的研究思路进行。

(5)在分化发育的分析思路上可以从全局到局部。首先可以研究整体的一个分化轨迹,然后再研究关键细胞类型分化的调控机制,再或者也可以验证前人提出的分化发育假说。

(6)多组学的结合可以讲一个完整的分化发育及基因调控的故事。因为单细胞转录组数据主要构建分化轨迹和筛选决定分化命运的关键基因,要是结合scATAC-seq就可以研究候选基因的调控基因网络,可以讲一个完整的故事。

案例一

中文标题:scRNA-seq揭示了茶叶中儿茶素酯的发育轨迹和新的代谢途径
英文标题:Single-cell transcriptome atlas reveals developmental trajectories and a novel metabolic pathway of catechin esters in tea leaves
发表期刊:Plant Biotechnol J(IF=13.26)
发表时间:2022年7月

研究目的

茶叶独特的味道是由特定的代谢物引起的,尤其是儿茶素酯,但它们在不同细胞类型中的形成机制还不清楚。

测序样本:取第1叶和第3叶进行scRNA-seq。

研究结果

1. 使用显微镜观察来鉴定嫩叶的细胞类型


对两个嫩叶进行scRNA-seq,为了方便后续的细胞类型鉴定,作者使用不同方法检测茶叶切片的横断面细胞类型,经过对单细胞数据的分群和细胞注释发现,共分了16个亚群,细胞鉴定了10种细胞类型,详细细胞注释如图1C所示。

图1 茶叶单细胞图谱

2. 嫩叶茶叶的分化轨迹分析

为了验证细胞类型,探索茶叶的连续分化轨迹,作者对所有细胞进行拟时分析,并且根据样本的分化关系将1L样本的增殖细胞和原形成层细胞作为早期分化细胞的起点。拟时分析发现分化轨迹有4个分支点,所有细胞分为9个状态,并且在起始点能够分化1L的细胞占大多数,表皮细胞分布在所有9种状态中。接着进一步分析了参与茶叶生长发育的关键基因,图e的50个基因是与苯丙素和类黄酮生物合成相关的基因。BEAM分析了决定这四个分支点的分化命运基因,共发现8个关键基因,包含参与角质生物合成、植物表皮形态发生等功能的基因f。基于这些分析结果,作者绘制了嫩叶的细胞分化和发育轨迹,并且表注了各个状态和分支点的关键基因。

图2 嫩叶的分化轨迹和分化发育的关键基因

案例二:

中文标题:scRNA-seq揭示调控棉花纤维细胞生长的分化发育基因
英文标题:Cell-specific Clock Controlled Gene Expression Program Regulates Rhythmic Fiber Cell Growth in Cotton
发表期刊:research square
发表时间:2022年9月

研究目的

棉花胚珠表皮产生纤维,是全球纺织工业最重要的天然纤维素来源。目前,纤维细胞生长的分子机制尚不清楚。本研究建立了一种优化的原生质体构建方法,将scRNA-seq和scATAC-seq结合,对野生型(WT)和突变体陆地棉(fl:无绒毛/无毛棉)胚珠外被膜(OI)细胞进行了系统的表征。

测序样本:分别对WT和fl样本进行scRNA-seq和scATAC-seq,其中scRNA-seq共4个样本,scATAC-seq共2个样本。

研究结果

首先作者将两个样本的单细胞数据聚类分了5个大类,并且发现突变体细胞没有C3亚群。接着对全部细胞进行拟时分析,并且结合bulk RNA-seq的基因表达趋势发现C1、C2和C3细胞在发育过程中表现出早期、中期和晚期的表达,而C4和C5细胞在发育过程中没有表现出明显的变化。因此,作者确定C1- C3是纤维细胞谱系,其中C1代表早期的细胞。然后对C1-C3亚群进行拟时分析发现了它们的拟时间轨迹图,并且利用命运分化差异分析和RNA-seq的基因表达趋势发现了C2中驱动纤维细胞分化成C3的关键基因为GhMYB25,该基因可能在纤维原基细胞中起到先锋激活的作用,诱导和决定细胞向纤维原基细胞分化的命运。最后结合scATAC-seq发现了两个顺式调控元件,它们通过调节纤维细胞中近1/3的高表达基因,调节线粒体的昼夜节律代谢和蛋白质转译。

图3 纤维细胞的发育轨迹图和关键基因表达热图

案例三:

中文标题:scRNA-seq揭示杨树木质部的分化发育轨迹(基迪奥客户文章)
英文标题:Single-cell RNA sequencing reveals a high-resolution cell atlas of xylem in Populus
发表期刊:J Integr Plant Biol(IF = 9.11)
发表时间:2021年8月

研究目的

木材是木料、纸浆和许多其他工业木材和纸制品的主要可再生资源。木材主要由木质部和韧皮部母细胞组成,其中木质部是水分运输和营养运输的关键结构,但目前对单细胞层面的木质部形成还不了解。

测序样本:取杨树幼苗第15茎节以下的片段进行scRNA-seq。

研究结果

对木质部的单细胞数据进行聚类分了12个亚群,鉴定了3大类细胞。然后对全部亚群进行拟时分析发现由木质部发育前体细胞(Xpc)开始分化,分别分化为导管细胞(Ve)、纤维和射线前体细胞(FRpc),然后再由FRpc分化为纤维细胞(Fc)和射线薄壁细胞(Rc)。最后进行分支和分化命运的差异基因分析发现了分化过程的候选关键基因,如在木质部发育早期,PagHB15可促进Xpc向Ve、Fc、Rc等细胞的分化;PagSND1联合PagMYB46/83可能在纤维早期中发挥重要作用;PagEXP6在导管形成初期起主要作用,而PagXCP1在导管形成的后期起关键作用。这些结果为将来从细胞水平研究林木木质部发育过程提供初步参考。

图4 杨树木质部分化发育轨迹图和分化的关键基因筛选

案例四:

中文标题:scRNA-seq揭示花生叶片分化发育轨迹(基迪奥客户文章)
英文标题:Single-cell RNA-seq describes the transcriptome landscape and identifies critical transcription factors in the leaf blade of the allotetraploid peanut (Arachis hypogaea L.)
发表期刊:Plant Biotechnol J(IF = 13.26)
发表时间:2021年6月

研究目的

叶片在植物的整体生存和功能发育中起着不可或缺的作用,目前的生理学和分子生物学研究方法为叶片的生长和行为提供了深刻的见解,但单个细胞在叶片发育中表现的功能异质性还是未知。

测序样本:取花生幼苗被黄化后的叶片进行scRNA-seq

研究结果

1. 花生叶片分化发育轨迹构建

对所有细胞聚类后注释为8个细胞类型,然后分析了花生叶片的分化发育机制,结果表明花生叶片分化发育过程存在明显的时间异质性,接着对4种不同分化命运的细胞进行差异分析,结果显示转录因子NAC002和SAP3在大多数细胞中高表达,而ERF4在海绵组织中上调,DREB1在叶肉细胞中被下调,整体基因表达分布表明NAC002可能决定了支撑叶细胞生长机制的许多方面,最后为识别细胞命运的具体途径,作者对拟南芥中的转录因子进行了同源交互网络分析,结果表明,乙烯(ETH)和茉莉酸(JA)途径具有最关键的调控作用。

图5 分化发育轨迹构建和关键基因分析

2. 叶肉细胞和表皮细胞形成机制

研究完整体后,作者又对亚群进行精细分析。首先对叶肉层的原基、实质和叶肉细胞簇进行拟时分析,结果显示,原基首先发育为实质细胞,进一步发育为栅栏层叶肉细胞。然后对表皮细胞的假说进行拟时分析,重建原基和表皮之间的轨迹,结果发现表皮层产生于原基之前,并不是直接从原基发展而来,但有一小部分表皮组织来源于原基。最后推断表皮具有两种发育模式,其一是茎尖分生组织(SAM)驱动原始表皮细胞,其二是原叶原基直接进化为表皮细胞。

图6 亚群轨迹分析及表皮形成示意图

案例五:

中文标题:scRNA-seq揭示调控玉米叶肉细胞发育的关键转录因子
英文标题:Single-Cell Transcriptome and Network Analyses Unveil Key Transcription Factors Regulating Mesophyll Cell Development in Maize
发表期刊:genes(IF = 4.14)
发表时间:2022年2月

研究目的

玉米叶肉(M)细胞在光合作用II和次生代谢等多种生物过程中发挥着重要作用。功能分化发生在M细胞发育过程中,但调节M细胞发育的潜在机制还不清楚。

测序样本:取10日龄叶片的叶肉(M)和束鞘细胞(BS)进行scRNA-seq

研究结果

对玉米叶片的单细胞数据进行聚类划分为8个亚群,其中细胞鉴定C0-C4为叶肉细胞,然后对这5个亚群的叶肉细胞进行分化发育分析,分化轨迹为常见的“Y”字形,根据拟时间的差异表达基因谱聚类为6个基因集,称G1-G6,接着对6个基因集与已发表的转录组数据进行分析,结果发现G1和G4中的基因表现出相反的表达谱,进一步的功能富集分析显示G1的基因主要参与核小体组装、三羧酸(TCA)循环和缺水反应等生物过程,而G4的基因则参与光合作用,为指定轨迹起源的准确性提供了额外证据,同时有助于解剖复杂组织的细胞异质性。WGCNA和TF ChIP-seq分析和验证了叶肉细胞发育的关键TF HSF和COL分别是叶肉细胞发育的早期和后期参与者。

图7 叶肉细胞分化轨迹构建和功能分析

今天的分享就到这里,需要做单细胞测序项目的老师可以联系基迪奥生物。

*未经许可,不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有,侵权必究。


本文作者:基迪奥-Jusser

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