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【微生物群落应用篇2】如何发表IF=16+的高分16S文章

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发表于 2022.9.16 10:24:27 | 显示全部楼层 |阅读模式
微生物群落研究,最根本的目的是找到疾病与健康、处理与对照……等表型差异的驱动因子,进而揭示相应的分子机制。为了达到这种目的,常通过①理化因素②生物分子实验③微生物数据④个性化分析⑤多组学关联分析(图1),这5种手段组合来进行数据挖掘。

根据研究目的的不同,上述五种要素可进行随意组合,那如何合理搭配要素,以解决相关生物学问题呢?带着疑问,我们开启基迪奥群落应用的第二篇文章,此次携手南方医科大学珠江医院的16S高分客户文章---探讨肠道失衡通过激活NF-κB-IL6-STAT3轴来促进前列腺癌和多西他赛的耐药机制。

图1 微生物群落的5种分析手段

Microbiome 2022 IF=16.837)[1]

#实验背景#

据报道,肠道微生物群参与了各种人类恶性肿瘤的进展和耐药。然而,它如何影响前列腺癌(作为肠外肿瘤)的机制仍然未知。抗生素暴露是影响肠道微生物群落并能够引起肠道生态失调的因素之一,与多种疾病有关。因此,本研究旨在初步阐明肠道生态失调与前列腺癌以及抗生素暴露之间的联系。

#实验取材#

小鼠模型:Abx组:饮用水加广谱抗生素;NC组:不加,FMT-Abx组:进行菌群移植;FMT-NC组:未移植。

临床患者样本:纳入35例55-90岁的男性前列腺疾病(良性前列腺增生或前列腺癌)患者。

收集小鼠和人粪便进行16S(v3-v4)测序。

#要素组合策略#

☑分子生物实验;☑微生物数据;

#实验思路#

本文依据其研究目的,以”分子生物实验+微生物数据“的要素组合策略,将全文分为5个板块:


板块1:首先基于免疫组化等分子生物相关实验,初步评估抗生素是以扰乱肠道菌群的方式促进前列腺癌生长;
板块2:接着,用具体的微生物数据说明菌群的响应机制--抗生素促癌生长与变形菌门富集相关;
板块3:分子生物实验继续探索抗生素促癌的分子机制--瘤内LPS激活NF-κB-IL6-STAT3轴;
板块4:分子生物实验发现肠道生态失调小鼠前列腺癌增殖和多西他赛耐药的机制--IL6-STAT3通路激活;
板块5:补充临床样本的微生物数据,并把临床特征与变形菌门关联,以验证小鼠模型结论的正确性。

#实验结果#

一、免疫组化初步证明抗生素以扰乱肠道菌群的方式促进前列腺癌生长

首先以分子实验建立抗生素-肿瘤-肠道菌群之间的联系,结果显示与NC组相比,抗生素干预有效增加了皮下肿瘤体积和重量(图2B)。FMT-Abx VS FMT-NC结果与之相同(图2E)。并用免疫组化进一步分析,发现在Abx和FMT-Abx组中,ki-67阳性肿瘤细胞数量上调(图2F)。

以上结果表明,抗生素暴露以扰乱肠道菌群方式促进小鼠前列腺癌的生长!

图2 抗生素暴露以扰乱肠道菌群的方式促进前列腺癌的生长

二、16S微生物数据证实抗生素促癌生长与变形菌门富集相关

成功建立抗生素-肿瘤-菌群之间的关联模型后,利用16S扩增子数据,具体分析抗生素暴露后患癌小鼠肠道菌群的变化。这部分主要涉及的分析点是β多样性分析、物种组成和指示物种分析。

2.1 β多样性分析

用UPGMA聚类树和主坐标分析(PCoA)来描述组间差异(β多样性),综合来看Abx和FMT-Abx组、NC和FMT-NC组之间菌群结构相似(图3)。

图3 UPGMA聚类树和PCoA分析

2.2 物种组成分析

从宏观的多样性层面得出各种菌群结构无明显差异,进一步深入群落内部,探讨对不同组的物种分布影响。门水平显示变形菌门在Abx和FMT-Abx组中显著富集(图4B);科水平上,Abx和FMT-Abx组的Muribaculaceae和Lachnospiraceae显著降低(图4C)。

图4 门和科水平的物种分布

2.3 指示物种鉴定

初步了解了菌群丰度的大致变化,结合LefSe分析鉴定各组具体的生物标记物,发现变形菌门在Abx组和FMT-Abx组中得分最高(LDA评分>5)(图5)。

有报道称,变形菌门相对丰度的显著增加是肠道菌群失衡的标志[2],本研究也证实变形菌门是抗生素暴露组的biomarker。表明抗生素可显著改变肠道菌群的组成!

图5 门水平的LefSe分析

三、抗生素促癌机制-瘤内LPS激活NF-κB-IL6-STAT3轴

阐明了患癌小鼠的肠道菌群响应特征后,继续探究肠道菌群是以何种方式来干扰抗生素促癌的,其中的分子机制如何?带着问题我们继续看。

3.1 LPS炎症诱导因子的来源分析

LPS炎症诱导因子,在多种人类肿瘤中均可检测到,但其来源有待弄清。根据16S结果,假设肠道菌群失调破坏了肠道屏障,LPS被释放,到达肿瘤。为了证明假设,进行了ELISA检测,结果显示NC组的粪便中LPS水平明显高于Abx组,但血清中LPS水平则相反。此外,观察到Abx组结肠有一定程度损伤(图6A),表明Abx组小鼠存在肠漏。并且Abx组肿瘤中LPS明显升高(图6B)

3.2 LPS促癌的分子机制

将来自大肠杆菌的LPS用于细胞培养(RM-1)——RT-qPCR和ELISA证实IL6因子升高(图6C)——(RPPA和GSEA发现IL6和p-STAT3(Tyr705)呈正相关,p-STAT3与p-p65(NF-κB的主要转录亚基)正相关)——LPS作用下RM-1细胞核中p-p65和p-STAT3增加(图6D),且呈现体外剂量依赖性(图6E)——在p65磷酸化抑制剂(BAY-11-7082)下,IL6的转录水平下降,p-p65和p-STAT3的蛋白水平也下降——收集用LPS培养肿瘤细胞的细胞上清,建立条件培养基(CM),与CM相比,加入IL6抗体后p-STAT3减弱(图6E)——综上,LPS激活NF-κB的情况下,IL6增加,可通过自分泌方式激活STAT3

与此一致,ELISA检测,与NC组相比,Abx组肿瘤组织裂解液和血清中IL6浓度升高。western blot和免疫组化显示,p-p65和p-STAT3也得到了相同的结果(图6F,G)。

表明,肠道通透性上调,瘤内LPS升高,激活了NF-κB-IL6-STAT3轴,对肠道失调小鼠的前列腺癌有促进作用!

图6 抗生素的促癌机制

四、IL6-STAT3通路的激活促进肠道失调小鼠癌增殖和多西他赛耐药

4.1 IL6-STAT3促进前列腺癌增殖

选择RM-1和DU-145(人CRPC细胞系)进行体外实验,western blot显示,p-STAT3在CM培养的细胞中增加,但在STAT3磷酸化抑制剂(Stattic)存在时减少(图7A)。并且,抑制IL6-STAT3通路可抑制前列腺癌细胞增殖(图7B,C)

在体内实验中,与Abx组相比,Abx+static组的肿瘤体积和重量(p<0.001)明显减小(图7D)。肿瘤组织免疫组化分析显示,与NC组相比,Abx组的p-STAT3、cyclin D1和c-myc增强,而Abx+static降低(图7E)。

以上说明IL6-STAT3促进前列腺癌增殖!

图7 L6-STAT3促进前列腺癌增殖机制

4.2 IL6-STAT3改善多西他赛耐药

进一步探讨多西他赛耐药与肠道菌群失调的关联机制。细胞活力和TUNEL实验表明,抑制IL6-STAT3通路可以改善前列腺癌细胞株对多西他赛的耐受性(图8B,C)。体内实验进一步证实了这一结论。并且多西他赛可显著降低正常喂养小鼠的肿瘤体积和体重,但对肠道失调小鼠无明显影响。然而,多西他赛和Stattic联合使用可显著降低了肿瘤体积和重量(图8D),并且p-STAT3、Bcl-2和survivin发生相应变化(图8E)。

这些结果表明,IL6-STAT3通路在肠道失调小鼠肿瘤中被激活,促进前列腺癌的增殖和多西他赛化疗耐药。

图8 IL6-STAT3改善多西他赛耐药

五、临床样本的微生物数据证明小鼠模型结论的正确性

最后就是加上临床样本与小鼠模型的群落结论相呼应,提高文章的实用性。对良性前列腺增生(BPH,n=20)、非转移性前列腺癌(n=10)和转移性前列腺癌(n=5)的患者粪便样本进行16S测序,所涉及的分析点与前面的小鼠模型一致,αβ多样性分析、物种组成、差异分析,比较特别的是作者将变形菌门与多个临床参数进行了关联:

①发现三组间α和β多样性无显著差异(图9A,B);②门水平物种组成表明,变形菌门在转移性前列腺癌患者中高于非转移性或BPH患者,并且在前列腺癌和BPH患者中也观察到差异(图9C);③但,LefSe没有鉴定到生物标记物。④随后,将变形菌门与多个临床参数进行相关性分析,结果显示变形菌门与血浆IL6水平、区域淋巴结转移情况和远处转移情况呈正相关(图9D)。并且,ROC曲线也显示,尽管变形菌门在预测远处转移方面无法区分前列腺癌和BPH,但它比PSA水平有更好的潜力(在转移性前列腺癌患者中往往更高)(图9E)。

图9 临床样本的微生物数据

本文点评

同样,我们以要素组合的角度来解析,作者为何要基于“分子生物实验+微生物数据”这种搭配方式来探讨这篇文章。

任何手段技术,都是为研究目的来服务的,本文作者主要是想阐明肠道生态失调与抗生素暴露的前列腺癌之间的联系。拆解来看,最起码要围绕两个关键论点进行论证。一是:抗生素暴露能否促进前列腺癌的生长,那这部分可以用分子生物实验来进行阐述,因为前人的研究中,已经报道很多癌症相关的指标,并且可以通过免疫组化直观的看出癌细胞的数量变化;二是:肠道菌群对抗生素暴露后的前列腺癌响应,那无疑这部分要结合微生物数据进行相关说明,并且作者还基于小鼠模型和临床样本进行了双重探讨,找到了前列腺癌的肠道生物标志物--变形杆菌。开发了一种前列腺癌辅助诊断或预测进展的方法。

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微生物群落应用篇之-16S+代谢关联

参考文献

[1]Zhong W, Wu K, Long Z, et al. Gut dysbiosis promotes prostate cancer progression and docetaxel resistance via activating NF-κB-IL6-STAT3 axis[J]. Microbiome, 2022, 10(1): 1-19.[2]Shin NR, Whon TW, Bae JW. Proteobacteria: microbial signature of dysbiosis in gut microbiota. Trends Biotechnol. 2015;33(9):496–503.

*未经许可,不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有,侵权必究。


本文作者:基迪奥-潇潇

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