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翻译组联合多种转录组技术研究融合基因调控机制

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许多癌症由于基因融合存在异常的肿瘤嵌合转录因子(OCTF),典型的如尤因肉瘤(EwS),在青少年和青年中常见的一种侵袭性癌症,存在转移或复发且5年总生存期小于30%。该疾病的基因融合发生在特定的FET基因家族和ETS基因家族之间,最常见的是EWSR1(EWS)和FLI1发生融合。与野生型ETS TFs相比,EWS::FLI1可以作为先锋因子,结合GGAA微卫星序列产生新增强子激活邻近基因,从而具有独特的功能获得性。下面就来一起学习一下Molecular Cell这篇文章,看看如何应用二代+三代+单细胞转录组,还有翻译组Ribo-seq、蛋白组等组学数据验证突变后转录因子的作用及鉴定新的潜在治疗靶点。
IF(202204)=19.328

中文题目:肿瘤嵌合转录因子驱动沉默基因组区域的肿瘤特异性转录、加工和翻译

#文章思路#


#研究结果#

1. 全长转录组和二代测序鉴定融合基因诱导产生的新转录本和新基因

对A673 EwS细胞系进行Pacbio全长转录组测序和分析,共得到145条(0.25%)来自于基因组但不能比对到参考转录组中的高质量序列,经人工验证,挑选了80条高质量序列为候选的新转录本。假设OCTF(肿瘤嵌合转录因子)可以靶向这些子集,通过A673/TR/shEF EwS细胞系,一种表达多西环素(DOX)诱导的短发夹RNA(shRNA))对抗EWS::FLI1,证明四条新的转录本(Ew_NG1-4)会受到EWS::FLI1的调节。经ChIP-seq实验验证了EWS::FLI1-结合到GGAA微卫星在转录起始位点(TSS)近端。EWS::FLI1峰和H3K27ac、H3K4me3激活标记相关,随DOX处理后shRNA介导的EWS::FLI1消耗掉而普遍下降(图1A)。通过qRT-PCR检测证实了这些转录本的下调,进一步表明他们在间充质干细胞中被诱导。EwS来源细胞,通过CRISPR-Cas9表达了EW2::FLI1融合。综上,EWS::FLI1对这些转录本的表达十分重要。最后,通过GTEx、HPA、TCGA数据库获得10522正常组织和10827癌症组织样本,从研究机构获得132份EwS样本,验证这些转录本的表达。四种转录本在EwS样本中高表达,在正常组织和non-EwS癌症组织中几乎检测不到表达。说明EWS::FLI1可能诱导EwS特异性的新转录本结合到在转录沉默基因组区域的GGAA微卫星区域。将这些新转录本称为“neotranscripts”,受“neogenes”(NGs)编码

接着,利用人类癌症样本二代转录组测序结果,鉴定了未与GENCODE参考转录组中注释重合,在多个EwS样本中检测到,且未在non-EwS肿瘤样本中检测到的转录本。和EwS特异性表达相关的neotranscripts有61个,比对确定26个EwS-特异性neogenes(Ew_NGs)剪接变异体。

图1 EWS::FLI1调控EwS-特异性转录本。A:Ew_NG1基因组区域;B和C:在-DOX和+DOX环境下,Ew_NG1-4和EWS::FLI1在A673/TR/shEF细胞中的qRT-PCR分析。

2. EWS::FLI1直接调控Ew_NGs表达

对siRNA或shRNA干扰或敲低EWS::FLI1之后的9个EwS细胞系分析EWS::FLI1在这些Ew_NGs中的可能作用。大多数Ew_NGs在细胞系中表达一致,在EWS::FLI1敲低后下调。此外,Ew_NGs在间充质干细胞(MSCs)中没有表达,大多数在EWS::FLI1表达的MSCs中受到强烈诱导。相反,癌症和正常组织野生型FLI1均高表达如急性髓系白血病和造血组织中未表达Ew_NGs。ChIP-seq结果表明GGAA微卫星结合的EWS::FLI1峰在Ew_NGs的TSS区域显著富集。26个Ew_NGs跨15个染色体分布不靠近着丝粒或端粒。通过Ew_NGs的基因组结构的可视化发现一些从相同的EWS::FLI1结合的区域双向转录产生存在复杂的剪切模式。H3K27ac HiChIP,蛋白质中心染色质构象作图法,在启动子-增强子链内还鉴定到了10个Ew_NGs包含EWS::FLI1结合微卫星。为了进一步确定Ew_NGs肿瘤-特异性表达,研究对EwS肿瘤和促结缔织增生的小圆细胞肿瘤(DSRCT)中进行了单细胞RNA-seq(scRNA-seq)确定了在EwS细胞中Ew_NGs特异性表达,但在微环境或DSRCT细胞中均未表达,如两个样本的UMAP结果(图2E)。对6个Ew_NGs三个不同的sgRNAs靶向DNA序列侧翼EWS::FLI1结合的微卫星上游进行CRISPRi,发现所有测试的Ew_NGs发生显著下调。两个微卫星的CRISPRi靶位点包括在Ew_NG17启动子-增强子链中对完全NG下调很重要,但EwS细胞没有明显的表型变化。综上,这些实验表明,大多数Ew_NGs的表达是EWS::FLI1结合在GGAA微卫星上的直接转录结果,该微卫星定位于其启动子区域或增强子启动子链。在具有非EwS::FLI1融合的EwS中也发现了Ew_NGs,如EwS::ERG和EwS::FEV,证实了这些罕见的EwS定义了变体融合诱导NGs的潜力。

图2 EwS-特异性neogenes特征。C:Ew_NGs和GENCODE转录本的TSS和最近EWS::FLI1结合GGAA微卫星之间的距离;D:两种双向Ew_NGs的基因组区域。E:EwS和DSRCT癌症样本的scRNA-seq UMAP结果呈现Ew_NGs的平均表达水平;F:NG1、2、3、4、8、12三种不同的guide RNAs CRISPRi实验;G:对两种EWS::FLI1结合的微卫星调控NG_17的CRISPRi实验(enh1和enh2)。

3. Ew_NGs编码EwS-特异性新生多肽(neopeptides)

在亚细胞分级分离后进行qRT-PCR和单分子RNA荧光原位杂交(smRNA FISH),发现neotranscripts均在EwS细胞的细胞核和细胞质中,在EWS::FLI1敲除后减少。在2个EwS细胞系中使用Ribo-seq发现16个Ew_NGs的RPFs的TPM>0.1,且在non-EwS细胞系中未发现类似表达的RPFs。仅比对上Ew_NG3低表达的RPFs在K562,一种慢性粒细胞白血病(CML)来源的细胞系也有表达。基于Ribo-seq覆盖、周期性和序列特征发现在8种Ew_NGs中存在17个ORFs。经Label-free质谱定量在10种EwS细胞系中鉴定到209种多肽,2个EwS细胞系经高pH反相肽(HpH)鉴定到55种多肽。其中5个与通过Ribo-seq预测来的ORFs匹配,其中3个在10种细胞系中均存在,它们与在Ribo-seq中检测到的Ew_NG3的ORF编码的预测88个氨基酸长肽的不同部分匹配,并通过PRM进行了验证。这些数据表明Ew_NGs包含可翻译的ORFs并能编码新的肿瘤特异性多肽(neopeptides)。

图3 EwS-特异性neotranscripts能翻译neopeptides。A:RPFs比对到在EwS和非EwS细胞系中Ew_NGs的热图;B:在10个EwS细胞系5个生物学重复的Ew_NG3的LFQ质谱结果;C:Ew_NG3两个外显子的基因组总览。

4. EWS::WT1在DSRCT中产生neotranscripts

DSRCT是EWS::WT1融合基因来源的软组织肉瘤。通过RNA-seq共鉴定到37种DSRCT特异性neogenes(DSRCT_NGs)与105种DSRCT-特异性neotranscripts。EWS::WT1在大多数DSRCT_NGs中表达,在EWS::WT1敲低后显著下调。使用JN-DSRCT-1细胞的ChIP-seq数据发现,在DSRCT_NGs TSS周围EWS::WT1峰显著富集。EWS::WT1-结合位点和RNA 聚合酶II相关。整合DSRCT和EwS癌症样本的scRNA-seq发现在DSRCT细胞中DSRCT_NGs特异性表达但在EwS或微环境细胞中未表达。

基于上述结果,作者提出OCTF-驱动的NGs标准:
(1)特定OCTF驱动的癌症类型特异性表达;
(2)细胞系中OCTF表达调控;
(3)在TSS附件或在增强子-启动子调控链中存在OCTF结合位点;

相反,某些癌症类型特异性NGs的表达似乎是OCTF独立的,并且可能与特定的起源肿瘤细胞有潜在的联系。

图4 DSRCT-特异性neogenes特征。A:在癌症和正常组织中DSRCT_NGs表达水平。B:A中EWS::WT1对DSRCT_NGs表达的调控。C:DSRCT_NGs和GENCODE转录本的TSS和最接近的EWS::WT1峰之间的距离。D:一个代表性的DSRCT新基因的基因组区。E:DSRCT和EwS肿瘤样本scRNA-seq的UMAP图显示DSRCT_NGs的平均表达水平。

5. 特异性新基因(neogenes)表征其他OCTF驱动的癌症

对其他16种OCTF驱动的癌症特异性neotranscripts进行鉴定。共鉴定到398 个NGs与807个neotranscripts。大多数是多重外显子(58.7%),有共有剪接位点(99%),进化保守性较低。血管瘤样纤维组织细胞瘤(AFH)和清除细胞肉瘤(CCS),两种癌症有非常不同的临床病理特征,但具有相同的OCTF(EWS::ATF1/CREB1),表达出许多常见的neotranscripts。肺泡软部肉瘤和TFE3-易位肾细胞癌表达相同的ASPSCR1::TFE3 OCTF。NGs直接受到相同OCTF调控。少量的NGs在肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)中存在,以异常的PAX3/7::FOXO1 TF为特征,在PAX3/7::FOXO1阴性胚胎性横纹肌肉瘤中也表达,表明这些NGs与共同的起源组织十分相关。

图5 含有转录因子的融合基因的癌症表达特异性新基因。A:在octf驱动的癌症中发现的所有新基因在癌症和正常组织中的表达水平的热图;B:新基因剪切位点序列logo

【总结】

1. 研究以尤因肉瘤(EwS)为例,分析肿瘤嵌合体转录因子(OCTF)的调控作用。在转录层面上,通过ISO-seq和RNA-seq鉴定到肿瘤特异性新转录本和新基因(Ew_NGs),并通过ChIP-seq找到结合位点。在对EWS::FLI1调控功能进行研究的时候,使用scRNA-seq区分EwS肿瘤和促纤维增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)之间Ew_NGs特性表达,发现在EwS中特异性表达。后续采用相同的策略研究另外一种OCTF——EWS::WT1在DSRCT中的功能。scRNA-seq结果发现DSRCT_NGs在DSRCT细胞中特异性表达,但没有在EwS或微环境细胞中表达。

2. 在翻译层面上,文章应用Ribo-seq技术发现8个Ew_NGs来源的17个ORFs有RPFs覆盖特征,即潜在的可翻译位点。结合LFQ鉴定到多肽能匹配到5个Ribo-seq鉴定到的ORFs中。结合PRM再次验证了其中Ew_NG3编码的多肽的存在。

3. 研究发现了肿瘤嵌合转录因子一种新的活性,即从沉默的基因组区域诱导RNA转录和加工。新转录本在患者中普遍存在,其中一部分被翻译成肿瘤特异性新蛋白,提供了新的潜在治疗靶点。

文中应用的三代全长转录组(PacBio、Nanopore)、二代RNA-seq(Illumina)、单细胞转录组、蛋白组(4D DIA、LFQ、PRM)、翻译组(Ribo-seq),基迪奥均可提供检测和数据分析服务,还有其他几十款测序产品,欢迎留言咨询获取属于你的个性化测序服务。

*未经许可,不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有,侵权必究。



本文作者:基迪奥-萌神

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