基迪奥提供翻译组测序服务已有多年，在保证实验流程稳定的情况下，不断优化实验方法，提升Ribo-seq结果比对率和三碱基周期特性，已成为业内能检测物种和样本类型最多、分析内容最丰富、且具备云分析平台的技术领先公司。经过时间的沉淀，我们也积累了丰富的项目经验持续协助客户发表文章。在今年上半年基迪奥客户又相继发表多篇应用Ribo-seq研究的文章，涉及多种研究领域和翻译组应用方向。
下面为大家解读的这篇文章，是基迪奥客户应用后转录调控常见三个组学，揭开白化茶树基因翻译图谱和代谢物特征，丰富了植物激素对作物品质的潜在调控机制方面的认识。
IF(202205): 4.342/Q1
- 中文名称：白化茶树（Camellia sinensis）的翻译图谱和代谢特征
- 合作单位：湖南农业大学
#研究背景#
白化茶树（Atps）因其独特的表型和风味成为最具吸引力的种质资源之一。虽然以往的研究广泛阐述了Atps的转录和代谢机制，但缺乏对翻译调控机制的理解和多组学整合。本研究通过整合转录组、翻译组和广靶代谢组研究结果，阐述了Atps的整体翻译及其对Atps代谢特征的影响，揭示翻译调控对叶片颜色变化的影响。
#研究样本#
取白化（EL）和健康（GL）茶树的两叶一芽进行转录组、翻译组和代谢组检测。
#研究思路#
#研究结果#
1. 叶片特性和光合作用差异
对叶片长度和宽度、芽的长度外观等进行统计，两组间无显著差异，说明叶片颜色的改变对叶片形态无影响。此外发现色素沉着下降，Chl/Car比值的下降导致了叶片白化。
图1 GL和EL中叶片特征和光合色素
2. 转录组和翻译组比较分析
质控获得clean reads，对EL和GL的转录和翻译图谱分别进行PCA分析，并进行Pearson相关性计算，用于评估样本重复性，研究随机挑选了21个差异表达基因（DEGs）验证RNA-seq结果可靠性。结果无异常，继续后续分析。
3. 基因翻译特征
为了探究影响茶树植物叶片颜色突变的翻译过程，首先研究了RPFs的特征。茶树中RPFs主要长度为32nt，大多数位于CDS区。但在EL组中，RPFs在CDSs中的比例从93.4%下降到89.0%，在5’UTR、3’UTR和内含子区域有所提升。说明UTRs区域RPFs的变化是由叶片颜色转变引起的。
图2 EL和GL转录和翻译响应特征
4. 转录和翻译调控模式分析及比较
对两个组学分别进行差异分析。mRNA和RPFs丰度呈现很高的相关性（R2＞0.5 in EL; R2＞0.77 in GL），其中在转录水平有1715上调的DEGs和1968下调的DEGs；在翻译水平有998个上调差异翻译基因（DTGs）和1025下调DTGs。下调的基因数目更多，说明EL组中基因表达普遍下降。对DEGs和DTGs进行KEGG富集分析，发现在两个水平上很少通路重叠，故而在翻译水平进一步进行GSEA-KEGG分析，发现类黄酮生物合成、光合作用、卟啉和叶绿素代谢在EL组中发生下调；氮代谢、硫代谢和MAPK信号EL组中上调。
用九象限图对基因两种水平变化趋势进行分析及分类，并对在两种水平上变化一致的基因进行了KEGG富集分析。结果表明几种碳相关的通路如光合作用、类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代谢等碳相关途径在这些组中富集，说明基因在转录和翻译层面主要协同调控EL的碳代谢。此外，发现三种植物激素合成相关通路，包括色氨酸、玉米素和类胡萝卜素生物合成相关，提示植物激素可能参与到了叶片颜色突变过程。
图3 EL和GL在转录和翻译水平调控。（A）九象限图（log2FC＞1）；（B）对九象限图中C和G区域进行KEGG富集分析。
5. 序列特征和uORFs介导翻译效率（TE）分析
基因TE的变化超过30000倍，TE和mRNA之间存在负调控，表明大量基因存在显著翻译调控。EL组TE的中值低于GL组，此外，192个基因的TE下调，120个基因的TE上调，表明EL组中基因TE受阻。
（1）分析基因各区域序列特征（序列长度、归一化最小自由能NMFE，GC含量）。结果发现基因CDS区域有更高的TE（log2TE＞1），更短的长度和更高的GC含量；对于3’UTR区域，更高和更低TE的基因特征差别较小；对于5’UTR区域，TE更高的基因有更高的NMFE和更短的长度。上述特征在两组中均存在。
5’UTR区域RPFs的百分比在EL组中更高，意味着位于5'UTR的少数功能元件可能参与了叶片颜色突变。在2523个基因的5’UTR区域鉴定到5955个uORFs。3103基因中有1739个RFs结合的uORFs，2981基因有1689个uORFs（EL组中平均1.8 uORFs/基因）。EL中uORFs总数和每个基因的uORF数量比GL多，说明EL表型有更多的uORFs分布。
图4 EL和GL的翻译效率和序列特征。（A）TE和mRNA丰度相关性计算；（B）TE的FC变化；（C）CDS区长度、GC含量和NMFE在四个TE组中的差异。
（2）分析翻译与不翻译uORFs的序列特征。结果发现，翻译的uORFs和不翻译的uORFs相比，uORFs和5’UTR长度更短；从uORF到dORF起始密码子的相对距离，以及从uORF到转录起始位点（TSS）的距离更短；可翻译的uORFs会抑制相关基因的翻译效率，越多的uORFs会增强翻译抑制。和GL相比，uORFs的TE在EL中更高，表明uORF翻译整体被激活。此外，对Kozak序列分析发现，可翻译的uORFs +4位置上的鸟嘌呤出现概率高于未翻译的uORFs。此外，翻译的uORFs的GC含量更高。
图5 uORF特征总览。（A）EL和GL组中uORFs长度分布；（B）EL组中uORFs序列特征；（C）不同翻译uORFs数量基因对应TE；（D）翻译和不能翻译uORFs的GC含量；（E）EL组中翻译和不能翻译的uORFs的Motif分析。
6. 代谢物特征鉴定
KEGG分析表明转录和翻译过程共同调控了EL组中类黄酮和植物激素代谢，研究接下来分析了EL和GL组之间代谢的差异。共鉴定到553种代谢物，包括生物碱、氨基酸、类黄酮、木质素和香豆素、脂质、核苷酸、有机酸、酚酸、单宁等等。56种上调的差异积累代谢物（DAMs），52种下调的DAMs（差异阈值VIP＞1，p＜0.05），类黄酮是主要的DAMs。14种植物激素根据丰度可分为三类。SA、ABA和IAA之间存在更显著的正相关（R2＞0.95），表明他们是EL和GL中典型的植物激素。
图6 EL和GL代谢组分析。（A）代谢物统计。（B）植物激素分析。（C）植物激素相关性分析。
7. 多组学分析吲哚乙酸和类黄酮代谢
植物叶片变绿通过产生叶绿素并受类黄酮等次生代谢产物的激素的影响。研究根据DEGs、DTGs和代谢物阐述叶片颜色突变和白化代谢机制。
对于植物生长素，参与到生物合成的ALDH、参与到信号转导中的AUX1、IAA、GH3、ARF在EL组中转录和翻译均发生下调，SAUR上调。而色氨酸和IAA含量在GL中高于EL，色胺在EL中高于GL，HY5是连接IAA和叶绿素通道的关键成分。HemA和POR下调，但HY5、HemH和CLH在EL中下调，表明叶绿色合成受到抑制是由于HY5表达量增加，因此分解代谢率增加。对于类黄酮，在翻译和转录水平，8种基因下调，2种在转录和翻译水平上调，11种代谢物下调，大多数黄酮苷在EL中上调。
研究接着分析了光合作用的差异调控，发现所有参与光反应的基因在EL水平上都下调，表明EL显著抑制了光合作用。R5PI转录显著上调但翻译水平下调，说明翻译修饰是光合作用的一部分，并影响了次生代谢物。
图7 植物激素、叶绿素和类黄酮代谢的多组学分析。（A）IAA代谢；（B）叶绿色代谢；（C）类黄酮代谢。
【小结】
①本研究打破传统以RNA为中心的观点，整合转录组、翻译组和广靶代谢组以新的视角鉴定翻译调控和代谢模式，揭开叶片颜色突变机制。核心调控因子HY5共同介导叶绿素和生长素代谢，进一步促进类黄酮积累。此外，这些机制是否导致了白化表型并抑制了碳代谢还有待证实。随着茶叶瞬时表达系统的发展，今后对Atps的研究可以集中在选定关键基因的鉴定上。
②文章在挖掘数据的时候，先分析了基因在转录和翻译水平分别的特征，接着放在一起分析在两个层面变化趋势相同的基因及其功能。并再以关键代谢物为核心，分析基因的表达，从而整合了基因和代谢物的信息，阐述了基因的变化对代谢物合成的影响，进而对表型产生的影响。
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本文作者：基迪奥-萌神
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发表于 2022.7.22 09:29:30
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千斤顶
发表于 2022.7.22 11:03:17
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