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代谢组时空变化研究的思路与应用——单组学篇

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发表于 2022.5.25 10:05:45 | 显示全部楼层 |阅读模式
在前面的分享中,我们已经总结了空间代谢组学常见的分析内容(戳链接),那这些内容在文章当中具体是如何应用的呢?整体研究思路如下面的纸飞机流程图。

空间代谢组的单组学研究思路图

01 评估样本切片检测可行性
空间代谢组的检测适用于成型的固体组织样本,包括病理、动物、植物组织样本。不同物种、不同组织,甚至是不同阶段,样本都存在不同,所以研究前首先需要咨询基迪奥的技术人员评估样本检测可行性,再取样用于检测。

02 确定检测方案,非靶or靶向
基于MALDI-MSI的空间代谢组检测更为稳定,分子量范围广,检测分辨率更高,但基质对于一些物质会存在一定的偏好性。所以在检测前,需要明确检测的目的,若要尽可能多的测出切片中的代谢物则选择非靶空代;若有某一特定物质需要检测,需要测试针对该物质的实验条件,进行靶向空代的检测。若为非靶检测,在文章讨论的时候,可以根据生理结构分区域全局描述代谢物的分布和表达,或对代谢物进行聚类分析,说明检测到的代谢物在不同区域分布差别很大,能据此划分出和H&E结果类似的区域。

03 目标代谢物分析
关于目标代谢物的时空分布变化可以基于非靶的检测结果,单独拿出来进行详细讨论;也可以通过优化检测条件,对靶向空代结果进行说明。目标物质通常来源于相同物种LC-MS等方法鉴定到的已知的关键代谢物、或其他类似研究中存在的代谢物、还有特定药物、标记后的物质等。

04 Biomarker潜力分析
除了在生理层面的讨论,还想将代谢物作为biomarker应用于如癌症早筛或诊断,需要大样本量,或单独的队列结合代谢组生信分析的结果对代谢物进行挑选,如通过OPLS-DA、PLS-DA的VIP值、ANOVA和T检验的P值、比较组间的差异倍数FC等筛选出差异代谢物,再通过机器学习的方法如ROC和决策树等验证代谢物能用于分组的可靠性。

05 分子机制分析
结合KEGG数据库进行富集分析,能了解目标物质的合成通路,和所在的关键通路,可以据此对其他相关物质结果进行讨论和分析,并挑选出关键的酶对其进行验证。此外,由于空代能提供物种的时空信息,可以讨论相同物质在不同部位下的多种合成途径。

上述的空代研究思路和方法,在不同研究中大同小异,但应用会有不同的侧重点,可能是某一个研究的主要的方法,也可能是点睛之笔;可能只是检测一下代谢物的时空变化,也可能是深入讨论代谢物的功能,所以我们需要灵活运用。下面列举了一些文献,这些文献研究目的或方向都有些不同,特点是除实验外,组学研究只用了空间代谢,希望能帮大家更好的理解其应用,并作为类似研究的设计参考。
一、免疫研究——新冠患者肾上腺病变研究
空代应用类型:为辅助方法,用于检测代谢物空间分布,验证组织功能异常

Nature Communications
IF(2021)=14.919

研究背景

进行性呼吸衰竭和高炎症反应是COVID-19的主要死因。已有研究发现COVID-19会破坏下丘脑-垂体-肾上腺轴,但关于严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)对肾上腺的趋向性和相关变化的了解相对较少,文章对COVID-19患者肾上腺组织进行了研究。


研究思路


a. SARS-CoV-2肾上腺趋向性。
由于血管紧张素转化酶(ACE2)和跨膜蛋白酶丝氨酸2前体(TMPRSS2)会促进SARS-CoV-2感染,使用免疫组织化学对二者表达和位置进行分析。双免疫荧光发现,ACE2与跨膜糖蛋白(CD34)和类固醇合成因子(SF1)共定位,TMPRSS2和SF1共定位。此外,冠状病毒刺突蛋白(s-SARS-CoV-2)与SF1共定位,三种蛋白的表达均用western blot进行验证。原位杂交发现s-SARS-CoV-2 RNA在肾上腺皮质清晰可见,反义s-SARS-CoV-2 RNA的检测证实了病毒在细胞内的复制,上述结果均进一步证实了病毒对肾上腺细胞的趋向性。

b. 病毒在肾上腺皮质癌细胞系中感染和复制。为了验证COVID-19患者尸检结果,作者对两种肾上腺皮质细胞系进行感染实验,通过RT-qPCR、FISH、western blot和免疫组化分析发现病毒会在细胞内复制,并能上调IL-6引发炎症反应,IL-6在COVID-19患者中升高,与不良临床结局相关。

c. 肾上腺炎症。对SARS-CoV-2阳性患者肾上腺进行淋巴细胞、组织细胞、浸润检测,并给出每个患者(n=31)的H&E图像。结果发现淋巴细胞浸润,79%的炎症浸润细胞中心的凋亡,和流感患者相比,皮层CD4阳性T细胞数量和CD68阳性巨噬细胞明显增多。

d. 肾上腺血栓形成和出血。作者用H&E染色、Masson三色染色和抗纤维蛋白免疫组化检查肾上腺血管发现,58%的COVID-19患者毛细血管扩张,微血栓清晰可见,肾上腺皮质分区被显著破坏。对死后患者下丘脑和垂体进行了组织形态学分析,未见明显炎症浸润,无出血或坏死迹象,未发现明显的结构异常。

e. 和COVID-19相关的肾上腺的代谢组变化。研究通过空间代谢组对组织进行检测,在m/z 75到1000的范围内检测到4663个MS峰,通过热图层级聚类分析,可以根据代谢物表达明确区分COVID-19和流感两组,代谢分布在COVID-19和流感之间存在明显差异。COVID-19患者的磷脂酸和磷脂酰肌醇高强度,而流感组的肌醇环磷酸和核糖磷酸表现为高强度,主要富集的通路包括甘油磷脂代谢、戊糖磷酸代谢、抗坏血酸和醛糖酸代谢。类固醇代谢组分析显示,与流感组相比,COVID-19组的可的松强度降低,表明肾上腺皮质类固醇产生紊乱。

小结:
研究先后通过免疫组化等方法证明发现在伴有肾上腺炎的危重症患者中SARS-CoV-2有肾上腺趋向,病毒会在此增殖,最后通过空间代谢组说明肾上腺代谢紊乱进而证明肾上腺功能上的损伤。鉴于肾上腺在应激反应和免疫调节中的核心作用,这一发现具有高度的临床价值,有助于密切监测COVID-19患者在急性应激状态和恢复中的下丘脑-垂体-肾上腺轴。

二、病理研究——干眼症不同区域代谢物分布研究

空代应用类型:研究的主要方法,用于检测代谢物在正常和病理组织中不同区域的空间差异分布

The Ocular Surface
IF(2021)=5.033
关键词:干眼症 眼球 空间代谢组原位检测不同部位代谢物差异

研究背景

干眼症(DED)是一种慢性多因素疾病,影响着数百万人,患病率很高并持续上升,但发病机制尚不清楚,若能更好地理解DED病理基础的分子机制,将更有利于新的靶向治疗方法开发。


研究思路


a. 干眼症模型损伤评估。
研究设定两组雌性小鼠,对照组(Con)和干眼症组(DED)。为了确定DED造模成功,研究了泪膜的泪液体积和泪膜破裂时间(BUT),发现DED组均低于对照组;过碘酸-雪夫(PAS)评价眼睛的组织病理学损伤,DED组杯状细胞数量明显低于对照组;此外,利用角膜荧光素染色图像验证了角膜上皮损伤,TUNEL染色发现DED组有更多的凋亡细胞。

b. 中央角膜原位代谢谱。使用MALDI-MSI可视化中央角膜的代谢物变化,PAS染色用于结果比较,发现Con和DED之间存在明显差异,磷脂酰乙醇胺在DED中显著增加,甘油磷脂代谢可能是与DED相关的主要代谢途径之一,且相关的甜菜碱在DED中减少。笨丙氨酸代谢是另一个显著变化的通路,苯丙酮酸和l -苯丙氨酸在干眼症患者中显著降低。

c. 外周角膜的原位代谢谱。组织病理学染色结果用作MALDI-MSI对照,发现与DED相关的代谢物聚集在鞘脂代谢途径中,鞘磷脂和神经酰胺在DED中增强。

d. 结膜穹隆的原位代谢谱。MALDI-MSI检测发现,与DED相关的代谢产物分别映射到两个密切相关的代谢通路上,一个是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,另一个是半胱氨酸和蛋氨酸代谢。DED组中甜菜碱、肌酸和3-亚硫丙氨酸上调。与中央角膜相似,结膜穹窿的甘油磷脂代谢也发生改变,其中磷脂酰胆碱和2-溶血磷脂酰胆碱在DED中增加。

e. 眼睑和结膜的原位代谢谱。MALDI-MSI检测发现两组间差异代谢物富集到甘油磷脂代谢通路中,磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺在DED中上调,磷胆碱在DED中下调。

f. 房水的原位代谢谱。KEGG富集分析表明,DED组房水鞘脂和甘油磷脂代谢发生显著变化。磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺增加,磷脂酰胆碱也能转化为2-溶血性卵磷脂,均显著增加,鞘磷脂、神经酰胺和糖基神经酰胺水平升高,L-精氨酸(Arg)降低。

小结:
研究通过空间代谢组配合PAS染色,分析了正常眼组织和干眼症之间6个部位的代谢物原位表达的差别,并结合KEGG富集分析发现甘油磷脂代谢是主要改变的代谢途径之一,鞘脂代谢的增强是外周角膜和房水代谢途径的另一个显著改变,氨基酸代谢也发生了明显的变化。研究为进一步了解干眼症的病理生理机制提供了新的见解和线索,并为早期的个性化临床干预奠定了基础。

三、生物标志物鉴定——乳腺癌组织研究

空代应用类型:研究的主要方法,用于检测代谢物在正常和癌症组织中空间差异分布,寻找潜在biomarker。

Theranostics
IF(2020)=11.556

研究背景

乳腺癌是最常见的癌症,也是全世界妇女癌症发病率和死亡率的主要原因,代谢重编程是癌症细胞在不利条件下生长和增殖的主要标志。肉碱类物质是肿瘤细胞代谢过程的重要调控因子,影响着关键代谢物、通路和因子,为癌细胞提供生物合成和能量代谢,破译肉碱系统有利于解析癌症发展。


研究思路


a. 代谢物全局鉴定。对乳腺癌组织切片进行非靶向MSI检测,通过K-means和PCA的聚类方法对代谢物进行聚类分析,正常组织(NT)和癌组织(CT)区域显著分开,且结果相差很大。左旋肉碱和各种短链酰基肉碱如乙酰肉碱,酰基肉碱C3:0,酰基肉碱C4:0在CT区域显著升高。

b. 目标代谢物条件测试。对与乳腺癌发展可能相关的肉碱物质检出条件进一步进行测试,以提升检测灵敏度,发现乙醇可以洗去多余成分,增强肉碱物质离子强度。使用优化后的方案对乳腺癌小鼠模型进行检测。异质性肿瘤组织可根据细胞成分进一步划分为癌区、间质区和脂肪区,通过PCA发现癌区和其他区域明显分离,并且肉碱明显高于其他区域,说明肉碱的改变是乳腺癌代谢重编程的一个重要组成部分。

c. 人类乳腺癌组织中肉碱的MSI检测。从58例乳腺癌患者中提取170份癌症样本和128份正常样本,128个正常样本可进一步分为109个正常间质组织和19个正常脂肪组织,进行MSI检测发现,六种肉碱类物质的表达在癌症区域更高。左旋肉碱和短链酰基肉碱是人类乳腺癌中变化最大的肉碱类型。在癌症中心区域含量最高,在远端正常区域含量最低。肿瘤中心区域肉碱的改变可能是由于缺氧时β-氧化的抑制,导致肉碱在缺氧肿瘤细胞的细胞质中积累。

d. 根据肉碱区分乳腺癌组织与邻近的正常组织。对数据log归一化后进行OPLS-DA分析,并用PLS-DA验证模型可靠。其中酰基肉碱C4:0的VIP值最大,ROC分析得到其AUC值为0.98,预测灵敏度为0.95,特异度为0.97,该物质最佳判别值3.39。对VIP>1的五种肉碱物质进行逻辑回归并进行ROC分析,在最佳临界值下,肉碱panel的准确率与酰基肉碱c4:0相同,对正常乳腺组织的准确率均为96.1%,对乳腺癌组织的准确率均为94.7%。

e. 肉碱代谢途径中发生变化的代谢酶的原位发现和验证。肉碱的变化可能引起脂肪酸的变化,故文章对脂肪酸的含量进行了总结,发现在肿瘤组织中表达显著上调,对相关的四种代谢酶进行连续切片的免疫组化检测,同样发现它们在肿瘤组织中高表达。CPT2和CRAT是首次在癌症组织中发现会发生变化,提供了新的治疗靶点

小结:
空间代谢多用于肿瘤微环境,和癌与癌旁组织中代谢物空间分布差异的检测。先描述全局代谢物分布和含量,再讨论目标物质或进行靶向检测。该研究为大样本量的空代研究,用空间代谢组的检测技术+常规代谢组学的分析方法,找到代谢物biomarker和关键代谢通路,极大地扩展我们对肿瘤代谢重编程的理解,并可能为乳腺癌的治疗提供新的可能的诊断和治疗靶点

四、植物生理研究——枸杞果实不同发育阶段研究

空代应用类型:研究的主要方法,用于检测果实在不同发育阶段代谢物的时空变化。

Talanta
IF(2021)=5.76

研究背景

几个世纪以来,枸杞作为一种传统草药和珍贵的滋补品在亚洲国家一直备受关注。揭示植物发育过程中重要内源分子的空间分布变化,对于研究枸杞果实中植物化学物质的生理作用、营养价值和潜在功能价值具有重要意义。


研究思路


a. 内源性分子整体检测。优化样品检测条件后,通过MALDI-MS/MS获得前体离子和产物离子,分别鉴定DHB基质正、9-AA基质负离子模式下检测到的代谢物。正离子模式下,获得胆碱、己糖、柠檬酸、蔗糖、甜菜碱。负离子模式下检测到酚酸和类黄酮相关离子。

b. 鉴定发育过程中已知关键的内源分子分布。枸杞可分为内、中、外果皮和胚乳,对三个发育阶段(S1、S2、S3)的三个不同枸杞果实切片进行检测。分别讨论不同的内源性代谢物含量及分布。

①生物碱:在所有发育阶段均可检测到胆碱和甜菜碱,随着果实发育而增加,在S3最丰富。胆碱是甜菜碱生物合成的重要前体,但在种子中的分布却不同。说明随着果实发育,甜菜碱的生物合成模式可能在种子和其他组织之间转移,提示可能存在不同的合成位点。
②有机酸:在果实发育过程中,柠檬酸在整个果实中分布均匀,随着发育成熟含量逐渐降低。
③糖:己糖在果肉和果皮中积累,随着发育过程不断积累,S3阶段达到最高。蔗糖主要分布在果皮中。
④多酚类:酚酸和类黄酮是枸杞果实中重要的活性物质,研究根据文献对三种酚酸和四种类黄酮进行了讨论,多酚类物质在成熟过程中,从种子边缘分布到整个种子,据此推断,果实在发育过程中种子内部结构发生了变化。

c. 未鉴定化合物的分布。对一些未注释的化合物分布信息进行了讨论,如m/z 112.90化合物在S1阶段,位于种子边缘,并在果实发育过程中向果肉组织中积累,表明该化合物与发育过程相关。m/z 409.38、m/z 329.01和m/z 465.02在三个阶段均可检测到,在S3阶段分布于外果皮,提示该化合物可能作为信号化合物增强植物防御机制并保护植物抵抗病原体侵害。

小结:
空间代谢组最常见的研究类型,就是对不同阶段的样本中的代谢物含量及分布进行分析。文章通常会讨论对于该物种或该类型疾病重要的一些代谢物,然后再讨论一些次要化合物。该研究明确绘制了枸杞果实组织中糖、有机酸、生物碱、多酚等物质的空间分布图,有助于更深入了解内源性化合物生理作用及理解代谢物生物合成和积累的过程。

呕心沥血整理只为帮助各位更好的开展研究,除了点赞、在看与分享(ღ( ´・ᴗ・` )比心),欢迎来基迪奥做空间代谢组,我们会提供更专业的个性化组学研究服务喔~




本文作者:基迪奥-萌神     

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