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SCENIC单细胞转录因子分析催更应用思路了?安排~

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近日咱们公众号后台收到了粉丝的催更消息,感谢大家一直以来的关注与支持与监督……当然我们说有下期就一定会有的,是小编疏于工作安排了,让下一期来的有些迟,让大家久等了,还请见谅了!那小编就不废话了,直奔主题~

上一期给大家重点讲解了SCENIC软件原理,但分析结果如何查看,以及在实际项目中如何应用呢?这也是大家接触一个新分析点时最关注的两个问题。今天小编就为大家一一解答,希望能为大家在单细胞转录组数据挖掘的道路上带来一些帮助~

一、SCENIC结果如何查看?

SCENIC分析即regulons(转录因子与靶基因调控网络)在单细胞水平的活性分析,分析结果即为各Regulons在不同细胞中的活性值,由于细胞和转录因子数量之多,分析结果十分庞大,图形就是结果查看的最佳方式。SCENIC结果图包含以下三种,其中热图和tSNE映射图是软件默认输出的,网络图则需要借助外源cytoscape软件完成,不同结果图对结果展示的侧重点有所差异。

1.1 热图

热图侧重于展示数据的整体情况,从全局查看Regulons活性异质性。在上次推文中已经为大家介绍过SCENIC默认输出的两种热图,一个是基于AUC值绘制的Regulons活性热图(图1左),这类热图主要用于比较同一Regulons在不同细胞中的活性,寻找Regulons特异性活化的细胞亚群;另一种是基于AUC二值矩阵绘制的Regulons开放性热图(图1右),这类热图可用于寻找细胞中开放的Regulons,有利于细胞亚群功能判断。

图1  Regulons活性热图(左),Regulons开放性热图(右)

1.2 tSNE映射图

tSNE映射图侧重于展示目标关注的Regulons在细胞中的活性分布。SCENIC通过Regulons活性值矩阵将所有细胞进行tSNE降维。通过tSNE图,可以对Regulons在每个细胞的活性和开放性进行可视化(图2)。需要注意的是这里的tSNE映射图并不是直接在细胞分群图谱中映射的,因此图中的聚类关系与细胞分群无关,如果需要展示细胞亚群信息,需要调取seurat对象中meta.data信息重新绘图。

图2 Regulon活性映射图(左);Regulon开放性映射图(右)

1.3 网络图

网络图侧重于展示Regulons之间靶基因调控关系,有助于进一步挖掘核心调控网络。每个Regulons包含了TF(Transcript Factor,转录因子)和靶基因的调控网络,不同Regulons之间可能会存在相同的靶基因,因此我们可以借助cytoscape软件绘制TF和靶基因的调控网络关系图(图3),将不同的Regulons关联起来,以此进一步挖掘核心的调控网络。

图3 Regulons靶基因调控网络图

二、SCENIC分析如何应用?

前面主要是为大家介绍了SCENIC分析本身的结果分析策略,但大家都知道单细胞数据分析点是非常丰富的,那么SCENIC在这个大的分析背景中如何发挥它最大优势,可以如何应用呢,我们在这里也为大家设定了三个应用情景,更加直观的展示SCENIC在单细胞数据分析中的应用思路。

应用情景1:探究单细胞异质性

细胞异质性是单细胞转录组最基础的分析内容,最常见的分析方法是通过亚群上调基因分析,查找各亚群中特征上调表达的基因。而SCENIC分析为细胞的异质性研究提供了一个新的分析思路,即从Regulons活性异质性入手,解析亚群之间的分子差异,并通过regulons网络分析进一步挖掘分子差异背后的核心调控网络。
例如2020年发表在Cell上的一篇关于小鼠内皮细胞异质性探究的文章[1],作者首先是分离纯化了小鼠的11个组织的内皮细胞(ECs)进行单细胞测序,从细胞图谱中可以看出不同组织来源的EC细胞表现出明显的异质性。作者从多个方向入手研究EC组织间异质性,包括转录因子分析,作者发现不同组织来源的EC细胞群之间存在明显的Regulons活性异质性,其中在肝脏组织来源的EC细胞中Gata4转录因子活性极高(图4左),并且Gata4基因也特征高表达(图4右),因此作者推断Gata4转录因子可能是肝脏发育中重要的调控因子。

图4 Regulons组织活性异质性

应用情景2:结合拟时分析探究动态变化的调控网络

不仅如此,SCENIC还可以与拟时分析相结合,共同探究驱动命运分化的关键调控网络。

如2020年发表在PNAS上关于小鼠急性肾脏损伤修复关键分子机制的研究[2],作者先利用拟时分析构建了损伤修复过程的分化命运轨迹图,然后借助SCENIC分析了不同分化命运下Regulons活性的异质性,筛选异质性较强的Regulons,并查看了靶基因表达变化,从图5中我们可以看到,在成功修复集群中,转录因子Hnf4a、Hnf1b和Pbx1驱动了多个与修复相关的基因的表达,包括各种溶质连接的载体Plxdc2、Gas2和Dab2,最终解析了小鼠急性肾脏损伤修复关键分析机制。

图5 肾脏损伤修复关键调控网络

应用情景3:作为多组学结合桥梁,关联scRNA与scATAC

scATAC是检测单细胞水平染色体开放性的技术,开放性越高启动子可接近性越大,那么这个开放区域对应的motif被TF识别并结合到的可能性就越大,因此scATAC与SCENIC有这天然联合的优势。二者强强联合,可以从多组学层面共同研究并相互验证转录调控分析结果的准确性。

例如2020年Cell Stem Cell上发表的一篇关于皮肤损伤修复研究的文章[3],作者采集小面积损伤8天/14天、大面积损伤14天、和未损伤小鼠皮肤组织样本进行单细胞转录组测序,通过组间差异分析、再分群分析将损伤修复亚群进一步定位至LWC(大面积损伤中心)区成纤维细胞亚群。然后作者借助SCENIC分析找出了真皮损伤后毛囊修复的有效调控网络(Hoxc9和Hoxb2),并且通过scATAC数据,作者在LWC区成纤维细胞中富集到了转录因子Hoxc9和Hoxb2转录因子结合的motif,从侧面验证了转录因子活性分析结果(图6)。

图6 真皮损伤修复核心调控转录因子

以上就是今天转录因子分析的全部内容了,后续会有更多精彩内容陆续分享给大家~


▼参考文献▼
[1]Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells. Cell. 2020 Feb 20;180(4):764-779.e20.
[2]Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Jul 7;117(27):15874-15883.
[3]Distinct Regulatory Programs Control the Latent Regenerative Potential of Dermal Fibroblasts during Wound Healing. Cell Stem Cell. 2020 Sep 3;27(3):396-412.e6.



本文作者:基迪奥-September        

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