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巧用数据,轻松驾驭转录组三大经典研究思路

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发表于 2021.11.5 09:41:19 | 显示全部楼层 |阅读模式
从实验设计、高通量测序、数据挖掘至可视化结果呈现,逐级递进盖起一篇科学研究类文章。关于转录组研究,可能我们的研究背景不尽相同,但是无论什么领域,按照研究目的和样本数,经典的转录组设计均可分为处理vs对照,梯度(一般3-5组)和大样本分析(>15)。对应常见分析方法为差异分析、趋势分析和WGCNA。以下是小编精心为大家整理的不同实验设计应与什么样的分析点结合进行转录组数据挖掘,一起学习怎样将这些分析点应用到我们的实际问题当中吧。

处理vs对照型
对于这款典型“2×n”类的实验设计,即2种处理:实验组+对照组,我们通常可利用差异分析获得两组之间的差异基因,这些基因也是后续开展数据分析及分子实验研究的重点关注对象。

梯度处理型

若实验设计有时间梯度或浓度梯度上的变化,那么可利用趋势分析将上千个DEGs进行模块的划分,研究表达量变化趋势。趋势分析是梯度设计类文章的核心分析点。

大样本型
加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)用于分析大样本型再合适不过了。WGCNA工具可以助力我们从大样本的转录组数据中挖掘与研究目的相关的候选基因或挖掘与表型数据相关的候选基因,广泛应用于农学和医学的各个研究领域,也可发掘新的调控关系网络,从整体视角的分析思路去解决更多生物学问题。

关于以上这些类型从数据挖掘至后续图形绘制,强大的Omismart均可助力广大科研工作者更快更高质量完成!接下来通过分享三篇Omicsmart实战文章,给大家解析怎样利用这些分析点解决我们的实际问题。

#Omicsmart实战一:处理vs对照型#

对于处理vs对照型实验处理,可利用Omicsmart中差异分析挖掘不同处理下的差异基因,后续对这些差异基因展开功能富集分析寻找目标通路,进而找到与目标通路相关的基因,这些基因也是后续开展分子实验的重点关注对象。下面我们来解析一篇Omicsmart客户文章,探讨这类文章的研究思路。

01 NAC转录因子BrNAC087参与赤霉素延缓菜心叶片衰老的过程[1]

   研究大类:植物
   研究物种:菜心
   发表期刊:Postharvest Biology and Technology
   IF=5.537

涉及Omicsmart工具:样本关系分析、差异分析、富集分析

研究背景
植物激素赤霉素(GAs)调节叶片衰老,但关于GA介导的叶片衰老抑制相关调控途径尤其在重要经济作物蔬菜中仍不清楚。本研究通过探索赤霉素介导的菜心采摘后叶片衰老抑制,以期为新的分子调控途径提供依据。

测序方案
实验组:100 μM GA3喷洒菜心;
对照组:蒸馏水处理。收获后0、3、5、7 d采样。

研究结果


    1. 样本关系分析

基于FPKM估算基因转录本丰度,结果展示有相对较高的基因表达(图1 A)。利用相关性热图展示组间重复性情况,评估样本间相关性的可靠性,发现三个重复样本之间存在很强的相关性(图1 B)。每个样本的表达丰度利用小提琴图展示(图1 C)。

图1 0 d、CK3 d和GA3 d叶片衰老的RNA-seq分析

    2. 差异分析

通过两两比较,利用韦恩图整合展示不同组之间的共有基因和特有基因的情况,在3组之间分别识别出4,682、5,059和2,362个DEGs(图2 A)。利用火山图分组展示数据的分布情况,发现与0d相比,2,975个基因在CK3 d上调,1,725个基因在下调;与0 d相比,GA3 d时有3,458个基因上调,1,601个基因下调;与CK3 d相比,GA3 d上调1,444个基因,下调918个基因(图2 B)。

图2 转录组测序样本差异分析

    3. 富集分析

利用GO和KEGG对DEGs进行富集分析。GO富集分析结果表明,DEGs富集在生物过程和细胞成分上,许多转录因子在分子功能上富集(图3 A)。KEGG富集分析表明DEGs主要富集于植物激素信号转导、氨基酸生物合成和苯丙烷类物质生物合成,表明衰老与植物激素和抗病性密切相关(图3 B)。

图3 对DEGs进行GO和KEGG富集分析

小结

1. 关于分析:这篇文章整体分析为转录组研究的经典思路。从样本关系、差异分析再到功能富集分析等,逐级深入,值得参考。

2. 关于图形:全文转录组测序分析相关图形全部由Omicsmart完成。采用热图展示样本关系,并直观的将Pearson相关系数呈现在图中;通过韦恩图与火山图展示差异基因整合与单组分布情况,多元呈现数据结果。Omicsmart还可进一步挖掘数据,比如,想要重点关注韦恩图中交集基因背后的功能,可通过Omicsmart绘制韦恩图后点击交集部分,获取基因列表,对这些基因展开富集分析。

#Omicsmart实战二:梯度处理类#

针对多个连续型样本(至少3个)的特点(样本间包含特定的时间、空间或处理剂量大小顺序)对基因的表达模式(在多阶段中表达曲线的形状)进行聚类的方法,趋势分析以整体为出发点找到具有相同表达模式的基因以及蛋白或代谢物等。关于梯度处理型实验设计同样我们也通过基迪奥客户文章,来探讨这类文章研究思路和分析方法。

02 胰岛β细胞分化CeRNA调控模型[2]

   研究大类:动物
   研究物种:小鼠
   发表期刊:Biomaterials
   IF=12.479

涉及Omicsmart工具:差异分析、趋势分析、富集分析

研究背景
前人研究表明,移植多能干细胞(PSCs)分化能分泌胰岛素的细胞,在治疗中有很好的前景。但仍需要更深入地了解胰腺内分泌细胞分化的基因,以克服技术上存在的限制。

实验设计
取未分化的iPSCs,以及分化早期(day 4),中期(day 14),晚期(day 21)的β-样细胞,开展lncRNA测序。

研究结果

    1. 表达趋势分析

本文实验设计有时间梯度处理,因此可利用趋势分析研究基因表达变化趋势。对差异表达的lncRNAs的表达模式进行分析,4个时间点的DEGs被归到6个具有显著趋势的模块中(图4)。

图4 DEGs趋势分析

    2. 富集分析

选择初始应答上调的显著趋势模块(profile 22)展开功能富集分析,预测潜在重要lncRNAs的生物学过程和分子机制。结果表明,其能够影响转录调节、细胞增殖、迁移和凋亡等生物学过程(图5)。

图5 显著profile22富集分析

小结

对于多组梯度的样本,利用趋势分析对基因进行归类,有助于我们找到目标基因和目标通路,迅速对结果进行解读。

#Omicsmart实战三:大样本类#

WGCNA最大的优势在于,能将多个样本中成千上万的基因,根据它们的表达模式划分到数十个模块当中,然后以模块为单位进行分析,降低了我们的运算量,由繁化简。那么接下来我们分享一篇基迪奥客户案例来进一步了解WGCNA的应用。

03 WGCNA共表达网络分析控制扇贝性别分化的基因[3]

   研究大类:水产
   研究物种:扇贝
   发表期刊:BMC Genomics
   IF=3.969

涉及Omicsmart工具:差异分析、富集分析、WGCNA

研究背景
虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)是东北亚沿海国家重要的双壳类水产经济物种,但对该物种复杂的性别分化模式的认识仍十分有限。本文筛选了与扇贝性别分化相关的基因,推测相关的调控通路。

实验设计
取雌(f)、雄(m)扇贝未成熟阶段(PyUm)、成熟阶段(PyM)、产卵期(PyO,PyS)扇贝性腺,设置6个分组:PyUmf、PyUmm、PyMf、PyMm、PyOf、PySm,每组3个重复,共18个样品进行RNA-seq测序。

研究结果

    1. WGCNA

雌性和雄性扇贝的基因被划分到了19个模块。根据样本表达模式热图分析结果,获得与雄性性腺显著正相关的模块,包括含有1,541个基因的turquoise模块,和有1,451个基因的green模块。与雌性性腺显著相关的模块,包括有1,371个基因的coral1模块以及有860个基因的black模块(图 6)。

图6 WGCNA样本表达模式热图分析

    2. 基因共表达网络

WGCNA还可以构建基因共表达网络,找出位于基因网络中心的核心基因(hub gene),往往更具有生物学意义。

通过功能富集分析,在与性别分化或性别决定最相关的5个模块中,筛选出49个基因,根据他们在雌性和雄性组中的表达模式中的相关系数分别构建共表达网络。结果发现,CYP1A4-like、GALKNT4为雌性组中核心基因;在雄性组中,DMRT1为负调控作用的核心基因(图7)。

图7 构建两种性别的共表达网络

小结

本文实属大样本类实验,这时需要用到更机智的分析方法,来厘清性别分化过程中复杂的基因调控关系网络。整篇文章依据从整体到局部再到点的思路,从样本→模块→核心基因→目标基因,最后推测了可能存在的性别分化的调控机制。若想要进一步了解WGCNA理论知识,可点击下方链接学习,解决你对WGCNA分析存在的疑惑。

https://www.omicshare.com/forum/forum.php?mod=viewthread&tid=7457&highlight

Tips
以上所有数据分析和图形绘制都可交给Omicsmart完成!

通过三篇不同实验设计类型的精选文章案例,相信大家已经看到基迪奥的实力!目前基迪奥推出的Omicsmart应用范围广,包含mRNA、WGCNA、小RNA、circRNA、lncRNA、蛋白、翻译组等多个分析平台,分析涵盖了各大领域(植物、动物、微生物),分析类型全面(样本关系分析、差异分析、富集分析、GSEA分析、WGCNA等),且样本类型丰富,应用图形种类多样(火山图、热图、小提琴图、富集气泡图、富集圈图、表达趋势图等),满足通往SCI道路的各种需求。

作为科研界颜值与实力并存的基迪奥无论在数据分析还是图形绘制都有非常成熟的经验,让你能够一键式分析,开挂式绘图,火箭式发文,满足你在科研道路上的各种需求!如下表格精选了部分基迪奥合作完成的不同样本类型转录组类Omicsmart客户文章,针对不同实验设计均可利用Omicsmart完成。

表1. Omicsmart客户文章实际应用精选

Omicsmart在线分析平台不仅能够完成完整的转录组数据分析,还支持高度个性化的图形绘制。这款最实用的SCI发文工具,大家一定不要错过!有相关分析需求科研人可以搭乘OM商城直通车(https://www.omicsmart.com/),赶快搭便车火速发文吧!


▼参考文献▼
[1] Zhong-qi Fan et al, A NAC transcription factor BrNAC087 is involved in gibberellin-delayed leaf senescence in Chinese flowering cabbage[J]. Postharvest Biology and Technology,Vol 181, Nov. 2021, doi: 10.1016/j.postharvbio.2021.111673.
[2] Huang, Yan et al. lncRNA Gm10451 regulates PTIP to facilitate iPSCs-derived β-like cell differentiation by targeting miR-338-3p as a ceRNA. Biomaterials, vol. 216 (2019): 119266. doi:10.1016/j.biomaterials.2019.119266
[3] Zhou, Liqing et al. Transcriptomics analysis revealing candidate genes and networks for sex differentiation of yesso scallop (Patinopecten yessoensis). BMC genomics, vol. 20,1 671. 23 Aug. 2019, doi:10.1186/s12864-019-6021-6


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