如何进行植物单细胞研究

基迪奥-李泽标

近四年来，单细胞测序技术迅猛发展，从低通量高精度的CEL-seq到高通量的10X Genomics仅用了三年时间。单细胞测序技术在肿瘤、免疫、发育等方向获得了良好的应用，但是在植物研究中一直应用较少。

植物单细胞现有结果

植物单细胞文章发表情况


早在2015年，Kenneth D. Birnbaum团队便借助融合荧光蛋白技术，特异性挑选了基础中心细胞（quiescent center, QC）细胞和中柱细胞用于CEL-seq分析，将单细胞测序与转录组测序联合分析，以细胞同一性指数（index of cell identity, ICI）进行细胞分群，首次在植物组织中完成了单细胞水平的标记基因筛选，挖掘出了新的QC细胞、中柱细胞、生毛细胞的标记基因，为后续的植物单细胞研究提供了一定的基础。

得益于SMART-seq2和 CEL-seq2技术对组织单细胞的高分辨率，Kenneth D. Birnbaum团队和Brad Nelms团队分别在《Cell》和《Science》发表文章，完成了对愈伤组织和性母细胞的分化研究。高精度的单细胞测序捕捉到了愈伤组织和性母细胞在进入分化阶段前的瞬息变化，打破了传统转录组的限制，这很大程度推进了植物细胞图谱的精细研究。

但是，也碍于SMART-seq2和CEL-seq2的低细胞通量，植物单细胞研究一度陷入低谷，难有突破。10X Genomics技术的高细胞通量为植物单细胞研究带来了新的突破口。2019年连续六篇文章利用10X Genomics技术研究了拟南芥的根系，从发育信号调控、突变株分子机制、抗逆机制三个大方向完成探究，附带完成了更进一步的标记基因筛选。

2019年严建兵团队建立了新的单细胞甲基化研究方法scBRIF-seq，并针对玉米花粉细胞进行甲基化研究，发现了四分体内的甲基化同步和不同四分体的甲基化差异性。这篇文章填补上了植物单细胞表观研究的空白，可惜的是本身偏向方法学研究，对表观分析较浅。

不同于动物组织的单细胞研究，植物单细胞研究仍处于早期发展期，目前的所有研究都集中于拟南芥根和玉米花粉，对象极度匮乏。由此可见，植物单细胞研究都还浅显，少有创新性的结论，这也是为什么植物单细胞文章可以达到高分文章水平但难以达到顶级期刊的要求。

现有植物单细胞文章研究思路

现有的植物单细胞研究主要由五个部分组成：基础数据质控确保测序数据质量，数据的降维及可视化构建细胞图谱，差异基因分析，拟时分析探寻细胞分化轨迹，构建互作网络分析细胞间调控机制。

细胞图谱无论在动、植物单细胞研究中几乎都是研究的起始。我们通过细胞图谱可以直观地观察单细胞测序结果，对细胞亚群间的关系有初步的认知。同时，细胞图谱也是研究稀有细胞、突变株和应激刺激的重要工具。



细胞图谱构建

差异基因分析是贯穿单细胞研究的重点分析内容。亚群特征基因分析、处理组之间的基因动态变化、分化路径上的基因动态变化，本质上都是差异基因分析。而在差异基因分析的基础上，我们才有进行下一步分子实验的指导方向。



差异基因分析

拟时分析是2014年提出的，五年来一直广泛应用于单细胞研究，尤其是发育分化方向，为过渡态细胞的发掘、分化关键基因挖掘提供了大量信息。在植物单细胞研究中主要用于寻找QC细胞，也有文章基于拟时轨迹探索基因动态变化，但是都缺乏建设性结果，可见，拟时分析在植物单细胞研究的应用前景还有待进一步发掘。



拟时分析细胞轨迹及基因变化热图

构建互作网络在普通转录组和单细胞转录组都是一项重要分析点。其在单细胞研究中得到了进一步拓展，从粗糙的样本间的调控网络挖掘细化到了精细的细胞间调控网络挖掘，与10X ATAC的贯穿分析更是可以将调控网络精细到单细胞层面。互作网络在植物单细胞研究中有着广大的应用前景。


TF调控网络图

植物单细胞未来研究方向

相较于植物单细胞研究，动物单细胞研究已经走出了很远。在思考植物单细胞研究该怎么完成时，动物单细胞研究具有很好的参考价值。


植物单细胞研究思路

1、多组织间的单细胞研究。从现有文献不难看出，植物单细胞研究呈现植物种类单一、研究组织类型单一的现状。如果能够打破这种单一性，对于植物单细胞研究具有重要的推进意义，即使研究深度浅也可以是后续文章的重要参考对象。
2、细胞亚群子亚群研究。我相信这是植物单细胞的下一步发展方向，研究更细致的细胞类型是单细胞研究的必经之路。尤其当已知的细胞类型已经达到研究瓶颈时，必然会向更精细的方向进展。
3、深层次的拟时分析。现有文献使用拟时分析大多为了寻找QC细胞，仅有的一篇10+文章就是将拟时分析与激素响应机制进行了关联；可见，深层次的拟时分析研究将是很好的突破点，挖掘稀有分化路径、探索新的细胞类型、构建健全的调控网络，都可以为文章增色很多。
4、定向特征基因研究。现在植物单细胞研究是很泛的，尤其是特征基因研究，最后的结果多为一个无意义基因集，分子实验只为了证明这个基因集可能对，缺乏具体的基因功能探究。后续研究如果能将特征基因与具体的功能方向对应，并辅以完善的分子实验，是有望达到顶级期刊要求的，例如Cell和Science的两篇文章就将研究具体到了具体功能方向。

植物单细胞研究难点

植物单细胞困囿在浅表的、小范围的研究中，是有其固有的研究难点存在的：
1、原生质体制备方法。动物细胞只要脱离组织就是单细胞悬液，植物细胞有细胞壁的保护，必须先制备成原生质体才能制备单细胞悬液。但是在原生质体制备过程中，有两大难题，酶解时间和缓冲液渗透压。植物组织伴随着发育程度和功能不同，具有不同的细胞壁厚度和液泡渗透压，这为不同植物组织间（例如全植株）甚或是复杂植物组织内（例如叶片）的单细胞分析造成了阻碍。
2、植物细胞间异质性低。植物单细胞间异质性不高，导致以前从bulk-seq获得的许多marker基因并不可靠，无法完成细胞分群。这一问题早在第一篇拟南芥单细胞文章便有提及。除此以外，低异质性也导致了外界处理后转录组的剧烈波动，使得处理后marker基因不可用，只能用映射的方式完成分群。
3、部分细胞体积过大。部分植物细胞为了物质储存，会形成巨大的液泡，最终也导致细胞体积增大，无法完成油包水结构的包裹。但这部分细胞分布是不集中的，在最后的GEM形成过程中产生了偏好。

植物单细胞研究难点解决方案

虽然植物单细胞研究有其固有的技术障碍在，但都是我们可以克服的：
1、针对原生质体分离问题，我们应当合理利用机械法，避免时间过长的酶解条件。即使细胞壁裂解不完全，也只是导致收集的转录本减少，而2016年已有文章针对单细胞测序深度问题进行了探讨，仅2000条reads就可完成分群。所以，原生质体悬液制备时的酶解条件设定应偏向于保证细胞活性。
2、针对复杂细胞类型组织的原生质体悬液制备，我们可以参考动物的神经细胞的单细胞测序，使用细胞核完成单细胞测序。细胞核的稳定性高于细胞整体，且不受到细胞大小的限制，可以近乎无差别地对所有类型细胞进行提取。这个方法可以有效解决细胞壁酶解带来的困扰。
3、针对植物细胞本身的异质性低问题，我们可以采取针对性的生物信息分析。针对植物单细胞分析，其实不少文章都提出了相应的算法，例如ICI算法、邻近突变算法等，基迪奥本身就善于做个性化分析，可以很好的为老师解决这方面的问题。

总的来说，植物单细胞研究还处于应用初期，样本单一，数据使用程度较低，是一个可以涉足并发高分文章的领域。今后的植物单细胞研究，无论是样本复杂度还是数据挖掘深度上的拓展，都会是一篇很不错的文章。

基迪奥一直秉持优秀的服务质量和定制化的个性分析，具有丰富的植物单细胞项目经验，欢迎想进行植物单细胞研究的老师联系我们。


来源: 如何进行植物单细胞研究