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m6A+翻译组——强强联合分析策略汇总

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迅猛龙

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发表于 2021.5.13 09:32:36 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.5.13 09:32 编辑

m6A因其普遍复杂的功能作用,成为表型差异(生长发育、疾病、逆境胁迫……)调控机制研究中,居高不下的热点。

翻译组因其对核糖体真实状态的最直接反映,完美照亮了RNA披荆斩棘走向蛋白的黑暗地带,也成为表型差异研究中的新晋贵族。

至此,这两大组学利器都已闯出了自己的一片科研天空,各自精彩。

那么,两组学强强联合,又会开创什么样的天地呢?

接下来,我们先从组学关联前景(why)、关联策略(how)两方面与大家分享,更多关联细节、案例解读,欢迎大家参加我们的直播课。

主题:m6A+翻译组关联分析策略和案例解析
时间:2021.05.13(周四)下午15:00~16:00

直播地点:B站
B站号:基迪奥生物
房间号:22356503


1.关联前景

1.1 m6A视角

为什么要开展这两个组学的关联分析呢?

首先,我们从m6A的角度看。随着m6A探索的积累,m6A功能也变得越来越丰富。如图1[1],比如RNA 5’UTR区的m6A可以开展不依赖cap的翻译起始;RNA CDS区的m6A可介导RNA的降解、稳定性增强;RNA 3’UTR区的m6A可介导降解、翻译增强等过程。此外,m6A还参与了RNA可变剪切、circRNA成环、非编码RNA翻译等调控过程。

图1 m6A功能示例

仅加上m6A的丰富功能,传统中心法则就可以被进一步丰富,如图2,m6A的修饰可以调控转录和翻译两大过程。

图2 被m6A丰富的中心法则

然而,对于我们关注的某种表型差异,m6A到底调控哪个过程呢?

经典的m6A研究更多的是与转录组结合。但比如图3的研究结果[2],就是很巧,m6A甲基化修饰的基因,在表达量层面没有显著差异,在翻译组层面,却有显著差异。

可见,对于功能强大的m6A,我们只关注左边的转录是很片面的,不一定能得出有价值的调控信息。

所以,更系统全面的m6A研究,需要翻译组的加盟。

图3 m6A+翻译与m6A+转录的对比

1.2 翻译组视角

然后,从翻译组的角度看。因为RNA表达的时空差异性,组间翻译过程的比较离不开转录组的协助,所以一份翻译组的报告,必不可少的有一幅九象限图。如图4,根据转录和翻译趋势,基因被分为9个区块。

其中,占比最高的绿色基因,是仅在转录组中有显著差异,暗示在转录层面有大量调控,但因为各种各样的原因,这些基因在后来翻译时没有显著波动(所以你筛选的差异基因有很多很多,但有一大片并不会产生后续效应,做转录组的你是不是有种被骗的感觉,没事没事,以后记得加上翻译组就好啦)

排名第二的一大片红色基因,是在转录翻译两个维度都有显著差异,但上下调方向相反,比如转录增强,翻译下降,就好像,转录有调控,但面对海量复杂且时时变化的信息,细胞及时更新航向,在翻译组又做了进一步调控修正。

只有极少量的紫色基因,是转录和翻译指挥一致,同步增强或减弱。但即使对这一部分基因,也面临着转录弱增强,翻译强增强等不同的调控程度。

图4 转录组翻译组九象限图

看完一幅简单的九象限图,着实觉得细胞们堪比一个繁忙强大的国家,每个调控过程一点也不简单,在风云多变的大世界,维持这样庞大体系的正常运转,真是了不起。

感慨之余,我们也清晰认识到非常重要的一点!

对于各色基因,翻译都是调控机制上的重要一环。具体的调控机制如何呢?m6A作为对翻译起始、增强有重要影响的潜在因子,自然可以大大丰富翻译调控机制的研究深度。

所以,更深入的翻译组研究,也迫切需要m6A的加盟。

综上,选择m6A-seq+ribo-seq强强联合,一起翻越挡在表型调控机制前的两座大山——转录和翻译,助力更新颖深入的调控机制研究。

图5 m6A-seq和ribo-seq关联示意图

2.关联策略

叨叨了一大通,我们都知道m6A+翻译怎么好了,如何开展分析呢?我们汇总最新研究成果,为大家总结了三类关联策略(图6)。具体应用时,可结合自己的数据,尝试筛选,综合使用。

图6 m6A+翻译组关联策略

2.1 全局视角

累积曲线

获得多组学数据结果后,可以使用甲基化数据和TE(翻译效率、translation efficienticy)数据,从基因整体趋势,直观展现分布特征,判断全局的m6A修饰与翻译的差异程度(两条曲线分隔的程度、分隔的位置等)。

虽然只是简单的累积曲线,但是多花些心思,也有广阔的操作空间。最粗糙的,就是把基因按m6A有无分成两条曲线,以log2FC-TE为横轴。

精细点的,如图7[3],考虑到m6A位置与功能特征有关,可以详细的按5’UTR、CDS、3’UTR区分组呈现。

图7 分区域累积曲线

由于RNA上m6A甲基化的密度不同,招募的reader类型也不同,还可按peak数量分类,如图8[3],呈现不同甲基化密度对应的翻译组TE趋势。

图8 分peak累积曲线

最后,如图9[2],我们还可以根据自己的实验组、对照组,选择分组特有的m6A修饰基因和所有基因,按TE绘制曲线,对比组间甲基化与翻译的关联差异。

图9 分组累积曲线


FC差异盒形图


累积曲线是全局的详细分布,分布趋势差异越大,图形越清晰好看。换一种形式,还可以使用盒型图,搭配统计检验。和曲线对应的,可以分不同细节展示,如图10[3],采用了甲基化分区的方式。

图10 FC差异盒型图

核糖体密度曲线

翻译组的一大特色便是在基因上定位了核糖体正结合的位点。结合测序reads,便可得到核糖体的分布变化。与m6A关联时,peak长度分布波动比较大,不利于直接组合。我们可以借鉴文章的思路,采用m6A预测的Motif,如图11。图左是Motif的整体结果,两条曲线对应Motif有无甲基化,横轴表示甲基化位点上下游60nt的区域,纵轴表示核糖体密度。图右,是挑选的两类具体Motif类型。

从图11[3]的结果可以看出,m6A修饰后,有显著的“核糖体暂停”现象,就好像大家忽然踩了刹车,出现了交通拥堵的路段。具体的差异机制,大家可以看文章的进一步解读。

图11 m6A motif 核糖体密度曲线

2.2 基因视角

全局是基因整体的趋势判断,想筛选定位具体的目标基因,我们还需要从基因层面入手分析。对于三组学,最简单有效的策略,就是维恩分析(图12[4]),寻找共有的显著差异基因。筛选到的基因,可以开展热图可视化展示、功能富集分析等转录组使用的常规思路。

图12 组学维恩分析

今天的多组学关联分析,你心动了吗?深耕转录组研究的小伙伴们,除了蛋白代谢,快来get m6A、翻译新技能呀。

对m6A、翻译组测序关联感兴趣的小伙伴们,欢迎咨询当地销售。

更多精彩内容,可以参加明天的直播课,我们和你一起交流分享。

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▼参考文献▼
[1] Where, When, and How: Context-DependentFunctions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers. 2019. MolecularCell.
[2] m6A-mRNA methylation regulates cardiacgene expression and cellular growth. 2019. Life Sci Alliance.
[3] m6A in mRNA coding regions promotestranslation via the RNA helicase-containing YTHDC2. 2019. Nature Communications.
[4] The N6-methyladenosine (m6A)-formingenzyme METTL3 controls myeloid differentiation of normal hematopoietic andleukemia cells. 2017.Nat Med.

本文作者:基迪奥-小鱼儿     

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