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客户文章 | miRNA-mRNA关联分析揭示马铃薯碱性盐胁迫响应机制

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迅猛龙

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发表于 2021.4.30 09:35:41 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.4.30 09:35 编辑

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,它在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因,每个基因也可以同时受多个miRNA共同调控。这类复杂的调控网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达[1]。目前miRNA研究的主要手段是借助高通量测序技术检测组织/细胞中miRNA种类及其表达水平,通过预测并验证miRNA靶向调控的基因,揭示miRNA发挥功能的分子作用机制。由此可以看出,miRNA-mRNA关联分析是研究miRNA作用机制的必经之路,二者关联分析广泛应用于细胞分化发育、疾病发生发展、药物筛选、分子诊断等各个研究领域。
那么具体如何应用呢?我们以基迪奥合作客户甘肃农业大学园艺学院秦舒浩教授课题组最新发表在International Journal of Biological Macromolecules期刊,通过miRNA-mRNA关联分析揭示马铃薯碱性盐胁迫响应机制的文章为例,解析一下miRNA-mRNA关联分析的应用思路。


发表期刊:International Journal of Biological Macromolecules
影响因子:5.162
发表时间:2021年4月
合作单位:甘肃农业大学

研究背景:
随着世界范围内盐碱地面积的持续增大,盐碱胁迫已成为限制植物生长最主要非生物胁迫。马铃薯(Solanum tuberosum L.)是全球粮食系统的重要组成部分,其生产力的发展也受到盐碱胁迫的严重限制。马铃薯盐碱机理相关研究多集中于其对中性盐的响应上,其响应碱性盐胁迫的研究相对空缺。

实验设计:
文章以青薯9号组培苗为实验材料,将组培苗接种于MS(pH=5.6)培养基中,在22℃、光照16h/暗处理8h条件下培养;21天后,转移至pH=8.2的MS培养基中,碱盐处理0/2/6/24h,构建碱盐胁迫模型;观察各处理组幼苗形态学变化,同时采集幼苗根部提取总RNA,建库测序,检测各组幼苗mRNA和miRNA表达变化,每组设置三个生物学重复。

关联思路:


结果解读:

1.miRNA-seq分析

作者前期文献调研发现miRNA广泛参与各种非生物胁迫和生物胁迫应答,因此作者从碱盐胁迫前后miRNA表达变化入手,探索青薯幼苗对碱盐胁迫应答的分子机制。文章一共构建了12个miRNA文库(0/2/6/24h,每组三个重复),组间差异分析结果显示,相比于对照组(0h),碱盐胁迫组(2/6/24h)一共检测到68个差异上调miRNA和100个差异下调miRNA(图1A)。miRNA组间表达聚类分析结果显示,碱盐胁迫下青薯幼苗根组织miRNA表达发生了显著性变化(图1B),表明miRNA在碱盐胁迫响应中可能发挥了重要的调控作用。

图1 青薯幼苗碱盐胁迫下差异表达miRNA

2.mRNA-seq分析

miRNA发挥调控作用的主要方式是通过靶向抑制mRNA的表达,调节细胞特定的生物学过程,辅助生物体应对环境变化。因此作者同时检测了各组样本中mRNA的表达变化,为miRNA-mRNA关联分析做准备。

①mRNA组间差异分析

文章平行构建了12个mRNA文库(0/2/6/24h,每组三个重复),组间差异分析结果显示,相比于对照组(0h),碱盐胁迫组(2/6/24h)一共检测到2,682个上调表达mRNA和3,049个下调表达mRNA(图2A)。mRNA组间表达聚类分析结果显示,碱盐胁迫下青薯幼苗根组织转录本发生了显著变化(图2B),体现了青薯幼苗对碱盐胁迫的响应。

②差异mRNA功能分析

作者进一步对碱盐胁迫下差异表达的mRNA进行了KEGG功能富集分析,结果显示,上调差异基因和下调差异基因富集到的信号通路中有12条信号通路是共有的,包括已报道与碱盐胁迫相关的植物激素信号转导、苯丙素生物合成和淀粉蔗糖代谢通路(图2C),并且随着胁迫时间的延长,通路富集到的差异基因数越多。

图2 青薯幼苗碱盐胁迫下差异表达mRNA

3.miRNA-mRNA关联分析

上述分析挖掘了碱盐胁迫下差异表达的miRNA和mRNA,作者接下来对两者进行了关联分析,尝试从miRNA-mRNA关联分析的角度解析植物胁迫反应。

①miRNA-mRNA调控网络构建

miRNA与mRNA关联必须满足两个条件:
1.miRNA与mRNA存在靶向关系;
2.miRNA与mRNA表达量负相关。

基于这两个条件,作者首先借助Patmatch软件对差异表达miRNA靶向的mRNA进行预测,然后从预测的mRNA中筛选出属于差异表达的mRNA,最后基于miRNA与mRNA表达量负相关对预测结果进一步验证,最终构建了包含20个响应碱性盐胁迫差异表达miRNA和33个差异表达mRNA的负调控网络(图3)。

图3 miRNA-mRNA调控网络

②碱盐胁迫响应关键信号通路

作者重点关注了青薯幼苗根组织响应碱盐胁迫相关的植物激素信号转导、苯丙素生物合成和淀粉蔗糖代谢通路,结合miRNA-mRNA负调控网络分析发现,这些通路中的基因受到了miRNA的负调控。如苯丙素生物合成通路中与木质素合成相关的HCT基因,在碱盐胁迫下由于miR4243-x表达下调,靶向抑制效应减弱而发生上调表达,促进木质素合成,以及植物次生细胞壁的形成;淀粉和蔗糖代谢通路中与蔗糖生成相关的SPS基因(蔗糖磷酸合成酶),在碱盐胁迫下由于novel-m064-5p表达下调,靶向抑制效应减弱而发生上调表达,促进蔗糖生成,增加植物体内可溶性糖含量,从而改变细胞渗透压(图4);而植物次生细胞壁的形成和细胞渗透压的增加对于抵抗盐胁迫具有重要意义。

图4 青薯幼苗碱盐胁迫响应信号通路

该研究首次利用miRNA-mRNA关联分析对马铃薯响应碱性盐胁迫的机理进行了探究,这项研究拓宽了我们对马铃薯碱性盐胁迫响应生理及复杂分子机制的理解,为后续马铃薯抗盐碱栽培及其产业健康发展提供科学依据。此外,获得的大量候选miRNA及mRNA对于马铃薯耐盐碱种质资源的创新及耐盐碱品种的培育同样具有重要价值。

从这篇文章我们可以归纳出miRNA-mRNA关联分析主要分为四步走:
第一步是筛选与表型相关的miRNA和mRNA;
第二步是利用软件预测并构建miRNA-mRNA调控网络;
第三步是利用功能富集分析调控网络中基因的功能,挖掘表型相关miRNA核心分子作用机制;
第四步是进行分子实验验证,借助qPCR验证miRNA和mRNA表达变化,或通过靶向沉默/过表达miRNA反向验证其功能。

以上miRNA-mRNA关联分析思路学会了吗?在基迪奥生物不仅有miRNA-mRNA关联分析,还有自主研发的包含miRNA-lncRNA/circRNA、转录组-蛋白组、转录组-代谢组、转录组-ATAC、转录组-m6A、转录组-甲基化、转录组-16s/ITS在内的10+关联分析报告,具备丰富的多组学关联分析研究经验,助力客户发表1000余篇SCI文章!欢迎有测序/分析需求的老师与我们联系~

参考文献
[1] Lu TX, Rothenberg ME. MicroRNA. J Allergy Clin Immunol. 2018 Apr;141(4):1202-1207. doi: 10.1016/j.jaci.2017.08.034. Epub 2017 Oct 23. PMID: 29074454; PMCID: PMC5889965.
[2] Kang Y, Yang X, Liu Y, Shi M, Zhang W, Fan Y, Yao Y, Zhang J, Qin S. Integration of mRNA and miRNA analysis reveals the molecular mechanism of potato (Solanum tuberosum L.) response to alkali stress. Int J Biol Macromol. 2021 Apr 18;182:938-949. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2021.04.094. Epub ahead of print. PMID: 33878362.

本文作者:基迪奥-September         

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