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脂质组检测技术与应用

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迅猛龙

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发表于 2021.2.23 10:38:58 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.2.23 10:38 编辑

说到脂质,我们不得不先提一提代谢。代谢过程是指生物体为维持生命活动、生长发育、抗逆胁迫等进行的一系列生理变化,而生理变化得到的产物即为代谢物。在众多类型的代谢物中,脂类物质是第一大类代谢产物,在脑、神经、肝脏、血液中的含量极高,广泛参与细胞生长、分化、衰老、死亡等过程。

作为细胞骨架物质、能量贮存物质,自上世纪70年代起,人们对脂质的关注从未停止。随着2003年“脂质组”概念的提出,大家将更多的目光集中在脂类研究上。随着脂质研究的不断深入,越来越多的脂质物质被发现,目前脂质权威数据库Lipid Maps中登记的脂质物质已达40,000多种,且物质总数仍不断上升。同时脂质参与的代谢过程也不断被人们解析,同类型脂质组研究的文章也在呈指数模式增长(图1)。尤其是国家自然科学基金“十三五”发展规划中提及的脂代谢研究,更是将科学的“天平”向脂质研究领域倾斜。

图1 图片来源于PubMed统计结果

由于脂代谢的重要性与脂类物质的多样性,脂质组研究逐渐从代谢组学中脱离出来,自成体系。根据脂质的母核结构,可将脂质分为8类物质:脂肪酰类(Fatty acyls,FA)、甘油酯类(Glycerolipids,GL)、甘油磷脂类(Glyceropholipids,GP)、鞘脂类(Sphingolipids,SP)、甾醇酯类(Sterollipids,ST)、孕烯醇酮酯类(Prenolipids,PR)、糖脂类(Saccharolipids,SL)、聚酮类(Polyketides,PK)、固醇脂类(Sterol lipids,SL)。

脂质组学(Lipidomics)是全面揭示脂质轮廓信息,包括脂质种类及其丰度的分析,以及它们的生物活性、亚细胞定位和组织分布的一门学科。围绕差异分析,获取不同处理下或同一处理下不同时间点的脂质表达丰度,筛选脂质biomarker信息是当前脂质研究的热点话题。脂质组学与其他组学的关联性研究,如:转录组、蛋白质组等,为疾病的发生、抗逆胁迫等研究提供了多维度的分子调控信息。

脂质组学应用

虽然脂质组学的研究起步较晚,但依然没能影响其在各领域的受重视程度。动物、植物、微生物研究中不断有脂质组文章的产出,研究方向也更加多样化。

1.预测疾病进程

疾病研究一直是医学领域不断攻克的方向,疾病的发生往往是由于细胞出现功能、代谢、形态结构紊乱所致。作为细胞膜主要组成部分,脂质代谢过程和丰度信息被作为衡量疾病进程的重要标志。2019年发表在《Proc Natl Acad Sci USA》上的文章,作者以感染埃博拉(EVB)病毒死亡患者、感染EVB后又康复的患者、健康者为研究材料,共鉴定到423种脂类物质,含盖4个脂质类别和19个脂质亚类,通过差异分析发现幸存者与死亡患者、幸存者与健康患者血浆中脂质丰度变化趋势完全相反,同时随着EVB病程的加重,心磷脂(Cer)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)丰度也在不断增加;而随着患者的恢复,磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)等物质含量逐渐减少。结合转录组数据进一步证实参与这些脂质合成过程的基因表达量变化与脂质丰度变化一致。该结果进一步证实了,特定脂质的丰度变化信息可揭示疾病的发展进程[1]

图2 血浆脂质组揭示埃博拉病毒不同发展阶段脂质丰度变化

2.靶向治疗位点开发

近年来随着精准医疗概念的提出,靶向药物治疗、靶向治疗位点开发一直是医学领域热点话题。由于脂质代谢异常与疾病发生和发展密切相关。通过调节脂代谢过程,获取脂质变化丰度信息,同时与表型特征关联分析为靶向药物的开发提供一个方向。2019年11月在《Nat Commun》上发表的一篇文章,作者用肠道特异性缺失组蛋白去乙酰化酶3(Hdac3)小鼠和正常组小鼠为材料,发现Hdac3缺失可使小鼠体内脂肪酸氧化速率增加,脂类含量减少,进而可使小鼠免受由饮食诱导的肥胖症,用体外给药抑制Hdac3表达也能产生同样的效果。该研究直接确定了Hdac3是预防肥胖和相关疾病的潜在治疗靶点[2]

图3 脂质组揭示Hdac3缺失对脂代谢的调控机制

3.微生物

在微生物中,已有研究发现肠道微生物群落组成会影响宿主对物质的吸收过程,进而调节宿主体内脂质丰度的变化。2020年9月发表在《ISME J》上的一篇关于鲸鱼肠道中微生物群落组成对脂类物质吸收过程的调节作用,作者利用鲸鱼的胃、小肠、大肠为研究材料,进行脂质组和微生物群落检测。发现在整个肠道中,脂质丰度变化与微生物群落组成密切相关。在鲸鱼胃肠道中检测到546种脂质涵盖8个亚类,其中蜡酯是胃肠道中最丰富的脂类物质,而在小肠中其丰度逐渐下降,在回肠和近端大肠位置,蜡酯含量降到最低,提示蜡酯主要在小肠的中远端被消化。进一步利用相关系数对蜡酯丰度和小肠中微生物群落进行相关性分析,发现蜡酯的消化与特定微生物有关[3]

图4

4.抗逆胁迫

由于植物的不可移动性,提高植物的抗逆品质一直是植物领域培育优良品种的重要指标。研究发现在逆境胁迫下,生物膜的渗透性对逆境的反应较为敏感。人们发现脂质分子与植物的抗旱性、抗寒性密切相关[4]。2020年6月发表在《Frontiers in Plant Science》中关于花生抗冷胁迫的研究中,基于转录组和脂质组关联分析,构建了花生耐冷性调控机制的代谢模型,其中高级脂代系统起着核心作用。该研究为深入分析花生耐冷性的分子机理,培育具备抗寒品质花生良种奠定基础[5]

图5

5.食品营养

在食品营养领域,不同年龄段的人群对奶制品或乳制品的吸收能力不同。人们发现奶制品中脂质分子组成会影响乳制品的品质,进而影响身体健康。2020年4月发表在《Food Chem》上的文章阐述了不同哺乳期的驴,其乳汁中脂质成分差异明显。当驴妈妈生出小马驹后,第一批乳汁中脂质物质与14天后乳汁中的脂质相差很大[6],同时在驴奶中鉴定到磷脂酰丝氨酸(PSs)、甘油二酯(DG)等脂类物质,这些脂类物质与加速脂肪酸氧化、降低胆固醇代谢有关。该研究直接为驴乳汁营养品的开发提供依据。


6.绿色能源

绿色能源的开发,为能源的可持续发展提供可能。2020年2月发表在《Bioresour Technol》的文章,综合阐述了微藻含有的极性脂质和非极性脂质向生物柴油的转化过程,以及极性脂质作为生物柴油的局限性。文章同时讨论了微藻种类、微藻培养条件对脂质含量的影响,为微藻脂质在生物能源领域的研究进行了概括性总结[7]


基于色谱分离的脂质组检测方式

1.气相色谱质谱联用(GC-MS)

原理:
将脂质样品加入气相色谱仪中,利用一定温度下不同化合物在流动相(一些惰性气体)和固定相中分配系数的差异,使不同化合物按时间先后在色谱柱中流出,从而达到分离的目的,使复杂的脂质分子得到有效分离。分离后的脂质分子进入到高真空质谱仪的离子源进行离子化,利用电场和磁场将不同离子按照质荷比(m/z)、保留时间、峰强度、峰面积等实现脂质定性定量。

优点:
1、分辨率高、灵敏度高;2、适用于小分子物质检测。

缺点:
该方法对检测挥发性脂质物质比较简单,而对于非挥发性脂质,如磷脂、鞘脂等需要进行硅烷化或者成酯的衍生化处理使其具有挥发性才能检测,增加实验难度和成本。

2.UPLC-MS

原理:
其检测原理与HPLC-MS检测代谢物一致,只是将色谱仪由高效液相色谱更换为超高效液相色谱仪,对脂质物质进行分离。根据固定相物质性质和分离柱中填充材料不同,可分为液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、排阻色谱法。其中以液-液色谱法为分离条件色谱仪应用最为广泛,同时该类型色谱仪按固定相和流动相的机型不同可分为正相色谱法(NPC)和反向色谱法(RPC),其中NPC可实现脂类物质间的分离,RPC可实现脂类物质内的分离。并且该分离方式与GC-MS不同的是,对难挥发性的脂类物质无需进行衍生化处理,可直接上样检测。因此其检测的脂质范围更广。样品在液相色谱部分分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测后得到谱图信息。

优点:
1、对脂质类型覆盖更广;2、实验难度低,一般无需衍生化,更适合大规模样本的分析;3、分辨率和灵敏度高;关联的Lipid Search软件可自动定性定量脂质分子、检出的物质种类多。

Tips:
Lipid Search软件可对nano-infusion或LC/MS实验中采集到的大量数据进行分析,实现脂质分子的自动鉴定和相对定量。该软件兼容Thermo Scientific TM三重串联四极杆和Orbitrap质谱仪采集的实验数据,配有最大的脂质组数据库,包含超过170万个脂质离子及其预测碎片离子信息,能够关联多个LC/MS实验中获得的脂质数据。

缺点:
成本高;会操作Lipid Search软件;具备一定的生信分析能力

除了以上提及的2种方法外,还有很多脂质检测方法,如薄层层析法(TLC)、鸟枪法、亲水作用色谱-质谱联用技术(HILIC-MS)、核磁共振法(NMR)、拉曼光谱法(raman spectroscopy)等,因为在实际检测中不常使用,这里就不做过多介绍。对于前期没有目标脂质,又想更多的了解更多的脂质信息的老师,我们更推荐您选择UPLC-MS检测。

今天的分享就到这里了,简单介绍了脂质组的应用和检测技术。而获取脂质信息后,如何分析脂质组数据,如何将脂质组与其他组学关联分析,后续也会不断推送给大家,请持续关注我们~

参考文献:
[1] Kyle JE, Burnum-Johnson KE, Wendler JP, et al. Plasma lipidome reveals critical illness and recovery from human Ebola virus disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(9):3919-3928.
[2] Dávalos-Salas M, Montgomery MK, Reehorst CM, et al. Deletion of intestinal Hdac3 remodels the lipidome of enterocytes and protects mice from diet-induced obesity. Nat Commun. 2019;10(1):5291.[3] Miller CA, Holm HC, Horstmann L, et al. Coordinated transformation of the gut microbiome and lipidome of bowhead whales provides novel insights into digestion. ISME J. 2020;14(3):688-701. [4] Higashi Y, Saito K. Lipidomic studies of membrane glycerolipids in plant leaves under heat stress. Prog Lipid Res. 2019 Jul;75:100990.[5] Zhang H, Jiang C, Ren J, et al. An Advanced Lipid Metabolism System Revealed by Transcriptomic and Lipidomic Analyses Plays a Central Role in Peanut Cold Tolerance. Front Plant Sci. 2020 ;11:1110.[6] Li M, Li W, Wu J, et al. Quantitative lipidomics reveals alterations in donkey milk lipids according to lactation. Food Chem. 2020 ;310:125866.[7] Arif M, Bai Y, Usman M, et al. Highest accumulated microalgal lipids (polar and non-polar) for biodiesel production with advanced wastewater treatment: Role of lipidomics. Bioresour Technol. 2020 Feb;298:122299.



本文作者:基迪奥-zero


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