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单细胞悬液制备|适用于组织消化的酶特性介绍

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发表于 2020.8.24 09:26:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2020.8.24 09:26 编辑

用于制备细胞悬液的样本主要是培养细胞系和各种组织,培养细胞系制备细胞悬液比较容易。组织包括流体组织和实体组织两类,流体组织制备细胞悬液方法相对容易,实体组织则多种多样,最主要的是组合酶消化法。

组织中细胞和ECM构成特点,决定了需要使用多种酶的组合来分别消化ECM和细胞间连接。各种组织中胶原蛋白等组成成分种类和比例不同,不同组织需要使用不同的酶组合和消化时间,才能制备出合格的细胞悬液。


今天我们来介绍集中组织消化酶的特性,下一期文章将继续介绍适用不同组织的对应组合酶。

消化ECM的酶

1.胶原酶

在组织制备细胞悬液过程中,胶原蛋白酶消化是不可或缺的。大多数商业化胶原酶都是制备自梭状芽孢杆菌,或为大肠杆菌表达的梭状芽孢杆菌克隆基因的重组蛋白酶,是粗提取物,具有多种活性,不仅含有能够降解天然胶原和网状纤维的胶原酶,还含有其他的一些蛋白酶如多糖酶、脂酶等,能够有效水解结缔组织和上皮组织ECM内的其他蛋白、多糖和脂质等,因此适用于组织消化。

胶原酶能够特异性的识别Pro-X-Gly-Pro序列,特异性水解X-Gly肽键的肽链内切酶,识别的序列高频率出现在胶原蛋白中,很少发现于其他蛋白中。

目前商业化的胶原酶中,根据胶原酶活性差异主要分为五种:胶原酶Ⅰ、胶原酶 Ⅱ、胶原酶 Ⅲ、胶原酶 IV、胶原酶 V,此外还有 VI、VII、VIII 等不同的类型。


2.中性蛋白酶(Neutral protease)

中性蛋白酶,也称分散酶(Dispase),是指能在中性、弱酸和弱碱性环境中作用的一类蛋白酶,反应速度快而温和、反应条件适应性宽,是一种非特异性的金属蛋白酶,主要用来从各种不同组织或器官中消化细胞外基质,释放并制备原代单细胞,或用于细胞培养中的细胞收获和接种转移,也被用于防止悬浮细胞培养时的细胞意外结团。中性蛋白酶比较温和,不会给细胞膜带来伤害,而且因为其来自细菌,故不会引入支原体或任何动物病毒。

中性蛋白酶常与胶原酶、胰蛋白酶组合使用,常用于胶原丰富韧性强的组织消化。

3.弹性蛋白酶(Elastase)

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,对邻近中性氨基酸的肽键具有特异性,同时其也具有脂蛋白酶活性,用于分解不溶性弹性蛋白。弹性蛋白酶主要存在于动物胰脏中,可由动物胰脏提取制备,工业用途也可由微生物发酵制得。弹性蛋白在结缔组织的弹性纤维中含量丰富,因此弹性蛋白酶经常用于解离包含大量细胞间纤维网络的组织,也用于从肺泡中分离ATII 细胞。通常与胶原酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶一起使用。

4.透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)

透明质酸酶是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶,透明质酸是一种酸性粘多糖,广泛分布于人体各部位,在ECM中具有限制水分及其它胞外物质扩散的作用,在各种结缔组织和皮肤中含量丰富。故透明质酸酶常用于消化这些组织,一般与胶原酶组合使用。

降解胞间连接的酶

1.胰蛋白酶(Trypsin)

胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶,对碱性氨基酸、精氨酸和赖氨酸的羧基参与的肽键具有特异性,可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸,是特异性最强的蛋白酶。胰蛋白酶主要是动物胰脏合成的胰蛋白酶原前体在肠道中受肠激酶活化而产生的,商业用胰蛋白酶多是重组大肠杆菌表达生产的。在组织解离的时候,纯化的胰蛋白酶需要与其它酶如胶原酶联合使用。

2.木瓜蛋白酶(Papain)

木瓜蛋白酶对动植物蛋白、酯、酰胺等有非常强的水解能力,特异性很低,可以降解大多数蛋白质底物。与胰蛋白酶相比,木瓜蛋白酶对神经组织中细胞的损害更小,故在神经组织制备细胞悬液时,多数都使用木瓜蛋白酶。

消化核酸避免细胞聚集的酶

DNA酶I(Dnase I)

DNA酶是水解DNA的一类核酸酶,包括内切酶 (DnaseⅠ、Ⅱ和限制性内切酶)与外切酶(外切酶Ⅲ、Ⅶ)。外切酶消化能力有限,限制性内切酶主要用于分子生物学研究,识别和切割专一的核苷酸序列,DnaseⅡ消化DNA的同时会损伤细胞,故组织制备细胞悬液时,常用DNnaseⅠ消化悬液中的DNA。

细胞悬液制备过程中,蛋白酶的消化会导致细胞损伤,DNA 释放到溶液中,导致溶液过于黏稠,多数DNA会附着在组织和细胞上,影响其他蛋白酶消化效率,同时游离的DNA会导致细胞聚集成团。这种情况下可以少量添加 DnaseⅠ,以消化核酸而不损伤完整细胞。

以上内容节选自基迪奥新书《单细胞测序完全解析》

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今天的内容就到这里了~

本文作者:基迪奥-周老师
               


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钵水母

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发表于 2020.8.24 21:04:05 | 显示全部楼层
不错不错不错,学习了
好好学习天天向上!
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钵水母

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不错不错不错,学习了
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钵水母

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发表于 2020.8.25 18:38:45 | 显示全部楼层

写的很好 但是我还是只想要奥币
就交换空间
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钵水母

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发表于 2020.9.24 09:04:42 | 显示全部楼层
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