提取建库栏，不能全是提RNA，DNA的帖子，也得有建库贴！

yuzhe891 · 发表于 2016.5.8 13:46:22

这个栏目下，说是提取建库，现在全是提取，没有建库，感觉瘸了一条腿呀！我来补补洞。

然后我发现我想上传一些建库protocal，结果选择主题分类，居然没有建库（如图），只能选择其他。版主改改吧？

我估计传上来，也没有人看，原因在于哪里呢？在于，实验室没有测序仪，建库也都是拿money送出去了。而且我发现我这个级别还有附件大小限制，本想传到百度云盘，估计没人看，所以暂时传一个，起到抛砖引玉的作用吧。我传的是Nextera® DNA Sample Preparation Guide，如果有人想要中文的，再联系吧。

这种protocal其实官网都有，需要的直接去找也行。ion torrent，illumina，三代等等。其实，如果有些女孩子，那些数学的东东实在搞不懂，又想进入测序行当，做做测序实验也是不错的选择，有经验的建库测序人员，工资也是相当可观的（哎，测序公司的建库成本，是他们的利润大头呢~~不要怪我说实话，大家都知道的秘密了嘛）。

其实想搞好数据分析，那些数据到底怎么来的，了解了解没有坏处吧，我刚进实验室的时候，学了一年建库和上机测序，然后才开始分析的自己测下来的数据，感觉这样挺好的，数据有什么问题，其实有些和建库测序环节，关系蛮大的。

估计帖子会沉，只是补充一下这个主题区，让论坛建设的更美好！

hld8124 · 发表于 2016.5.8 18:08:12

确实现在实验室没有条件去做建库，都是找公司

zhouqian2617 · 发表于 2016.5.8 21:14:24

有个问题，建库过程中rRNA污染是怎么来的，如何避免

yuzhe891 · 发表于 2016.5.8 22:01:44

zhouqian2617 发表于 2016.5.8 21:14
有个问题，建库过程中rRNA污染是怎么来的，如何避免

不好意思，我回答不了你的问题，我没有想过这个问题。但是我觉得你的问题也没有问全。

首先，这个问题应该不是建库的问题，还是属于建库前提取RNA并纯化环节的问题，我做RNA建库比较少，经验不足。

其次，你研究的是真核还是原核生物啊，我做的是真核，oligo (dT)就基本搞定了，rRNA基本没怎么干扰过我，我也基本忽略降解的问题了，原因是我研究的物种在这方面没要太多苛刻条件的必要。要是原核，估计更麻烦一些了，我没有任何经验了。

最后，RNA建库方法比DNA要多很多，感觉没有办法对某个问题一概而论的，所以你问的可能过于笼统了，detail不足。

要是RNA建库有经验的，可以给这位仁兄以解答。

yuzhe891 · 发表于 2016.5.8 22:03:21

本帖最后由 yuzhe891 于 2016.5.8 22:04 编辑

hld8124 发表于 2016.5.8 18:08
确实现在实验室没有条件去做建库，都是找公司

建库其实哪个实验室都有条件做，就是简单分子实验而已，虽说比较贵，但是比那些做细胞实验的省钱多了吧。现在就是很多老板都没做而已。

zhouqian2617 · 发表于 2016.5.9 08:22:03

yuzhe891 发表于 2016.5.8 22:01
不好意思，我回答不了你的问题，我没有想过这个问题。但是我觉得你的问题也没有问全。

首先，这个问题应 ...

真核生物啊。因为做了转录组测序，送去的大多数样品测完的结果比对rRNA，大多数有30%是rRNA。只有个别rRNA比较少。不知道这样的结果对后继的分析有没有什么影响？

小圆 · 发表于 2016.5.9 11:12:56

很好的建议，我们调整一下~

Wuii · 发表于 2016.5.9 12:23:19

zhouqian2617 发表于 2016.5.9 08:22
真核生物啊。因为做了转录组测序，送去的大多数样品测完的结果比对rRNA，大多数有30%是rRNA。只有个别rRN ...

主要原因是，，怎么都去不干净呗，运气不好
===========
达到30%的，那就是污染比较严重了
但也没关系，后期过滤掉，看看剩下的reads数目够不够，至少有10M才能定量吧

zhouqian2617 · 发表于 2016.5.9 16:23:36

Wuii 发表于 2016.5.9 12:23
主要原因是，，怎么都去不干净呗，运气不好
===========
达到30%的，那就是污染比较严重了

多的有50%呢。差异基因筛选的的时候用的fpkm值是基于read counts来算的吧。那rRNA 污染的样品的read counts 数就会因此少了很多吧？这样找出来的差异基因会不会影响？

Wuii · 发表于 2016.5.9 18:10:09

zhouqian2617 发表于 2016.5.9 16:23
多的有50%呢。差异基因筛选的的时候用的fpkm值是基于read counts来算的吧。那rRNA 污染的样品的read coun ...

反正就是有效reads 达到基本要求
我觉得就只能这样了。
污染超过50% 直接让公司重新给你测吧

martin1207 · 发表于 2016.5.12 11:09:55

楼主，我想要中文版的看一下，想了解illumina 在RNAseq 过程中的建库过程，如strand SE 等具体操作当然我也看了不少关于这个的文件，但总感觉之间有gap，连接不起来，而且经常会发生脑袋混乱。还有我想知道您那有没有raw data 的质控过程？我现在想对数据进行下过滤。对于接头的过滤有点困惑。

bestcg · 发表于 2016.5.13 09:18:36

楼主提议不错，常规的建库我们会交给公司去做，但有些比较繁琐的我们还是会选择自己建库，确实需要有一个这样的交流平台。

基迪奥-周煌凯 · 发表于 2016.5.14 11:05:32

说的很有道理。从我们公司自己走过的各种坑来看，很多后期分析遇到的问题，的确就是建库不理想导致。建库质量好，会规避很多问题。

chai1986 · 发表于 2016.5.20 13:45:04

学习了。

yuhan · 发表于 2016.6.27 15:59:11

不错，我是做建库实验的，可以交流些建库心得。对应用了解不够，学习了

yuhan · 发表于 2016.6.29 18:06:12

yuzhe891 发表于 2016.5.8 22:01
不好意思，我回答不了你的问题，我没有想过这个问题。但是我觉得你的问题也没有问全。

首先，这个问题应 ...

建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠上，80%乙醇洗磁珠的过程没有将rRNA洗除干净。在后续建库的时候，rRNA也跟着反转录参与了建库。导致后期测序时引入了rRNA数据。

yuhan · 发表于 2016.6.29 18:07:10

zhouqian2617 发表于 2016.5.8 21:14
有个问题，建库过程中rRNA污染是怎么来的，如何避免

建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠上，80%乙醇洗磁珠的过程没有将rRNA洗除干净。在后续建库的时候，rRNA也跟着反转录参与了建库。导致后期测序时引入了rRNA数据。

zhouqian2617 · 发表于 2016.6.30 13:01:06

yuhan 发表于 2016.6.29 10:07
建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠 ...

谢谢解答

fangsigong · 发表于 2017.1.7 15:08:12

yuhan 发表于 2016.6.29 18:07
建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠 ...

rRNA污染对差异基因的表达有什么影响吗？

fangsigong · 发表于 2017.1.7 15:11:41

rRNA如果全部参与被测序的过程，带来的影响是什么？
而且，在差异基因筛选时，用的是RPKM值，假如有的基因部分有点像，那得到的RPKM值会不会不准确？

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