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[其他] 提取建库栏,不能全是提RNA,DNA的帖子,也得有建库贴!

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发表于 2016.5.8 13:46:22 | 显示全部楼层 |阅读模式
这个栏目下,说是提取建库,现在全是提取,没有建库,感觉瘸了一条腿呀!我来补补洞。

然后我发现我想上传一些建库protocal,结果选择主题分类,居然没有建库(如图),只能选择其他。版主改改吧?



我估计传上来,也没有人看,原因在于哪里呢?在于,实验室没有测序仪,建库也都是拿money送出去了。而且我发现我这个级别还有附件大小限制,本想传到百度云盘,估计没人看,所以暂时传一个,起到抛砖引玉的作用吧。我传的是Nextera® DNA Sample Preparation Guide,如果有人想要中文的,再联系吧。


这种protocal其实官网都有,需要的直接去找也行。ion torrent,illumina,三代等等。其实,如果有些女孩子,那些数学的东东实在搞不懂,又想进入测序行当,做做测序实验也是不错的选择,有经验的建库测序人员,工资也是相当可观的(哎,测序公司的建库成本,是他们的利润大头呢~~不要怪我说实话,大家都知道的秘密了嘛)。


其实想搞好数据分析,那些数据到底怎么来的,了解了解没有坏处吧,我刚进实验室的时候,学了一年建库和上机测序,然后才开始分析的自己测下来的数据,感觉这样挺好的,数据有什么问题,其实有些和建库测序环节,关系蛮大的。


估计帖子会沉,只是补充一下这个主题区,让论坛建设的更美好!





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Eric_Young + 20 + 6
基迪奥-周煌凯 + 15 建库的重要性从来都不能被忽视。.
小瑶 + 15 就为了最一句话,我决定奖励15大洋给你~.
小圆 + 20 很给力!

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发表于 2016.5.8 18:08:12 | 显示全部楼层
确实现在实验室没有条件去做建库,都是找公司
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迅猛龙

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发表于 2016.5.8 21:14:24 来自手机 | 显示全部楼层
有个问题,建库过程中rRNA污染是怎么来的,如何避免
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 楼主| 发表于 2016.5.8 22:01:44 | 显示全部楼层
zhouqian2617 发表于 2016.5.8 21:14
有个问题,建库过程中rRNA污染是怎么来的,如何避免

不好意思,我回答不了你的问题,我没有想过这个问题。但是我觉得你的问题也没有问全。

首先,这个问题应该不是建库的问题,还是属于建库前提取RNA并纯化环节的问题,我做RNA建库比较少,经验不足。

其次,你研究的是真核还是原核生物啊,我做的是真核,oligo (dT)就基本搞定了,rRNA基本没怎么干扰过我,我也基本忽略降解的问题了,原因是我研究的物种在这方面没要太多苛刻条件的必要。要是原核,估计更麻烦一些了,我没有任何经验了。

最后,RNA建库方法比DNA要多很多,感觉没有办法对某个问题一概而论的,所以你问的可能过于笼统了,detail不足。

要是RNA建库有经验的,可以给这位仁兄以解答。
哈哈
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 楼主| 发表于 2016.5.8 22:03:21 | 显示全部楼层
本帖最后由 yuzhe891 于 2016.5.8 22:04 编辑
hld8124 发表于 2016.5.8 18:08
确实现在实验室没有条件去做建库,都是找公司

建库其实哪个实验室都有条件做,就是简单分子实验而已,虽说比较贵,但是比那些做细胞实验的省钱多了吧。现在就是很多老板都没做而已。
哈哈
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迅猛龙

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发表于 2016.5.9 08:22:03 | 显示全部楼层
yuzhe891 发表于 2016.5.8 22:01
不好意思,我回答不了你的问题,我没有想过这个问题。但是我觉得你的问题也没有问全。

首先,这个问题应 ...

真核生物啊。因为做了转录组测序,送去的大多数样品测完的结果比对rRNA,大多数有30%是rRNA。只有个别rRNA比较少。不知道这样的结果对后继的分析有没有什么影响?
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发表于 2016.5.9 11:12:56 | 显示全部楼层
很好的建议,我们调整一下~
哈啊哈哈
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发表于 2016.5.9 12:23:19 | 显示全部楼层
zhouqian2617 发表于 2016.5.9 08:22
真核生物啊。因为做了转录组测序,送去的大多数样品测完的结果比对rRNA,大多数有30%是rRNA。只有个别rRN ...

主要原因是,,怎么都去不干净呗,运气不好
===========
达到30%的,那就是污染比较严重了
但也没关系,后期过滤掉,看看剩下的reads数目够不够,至少有10M才能定量吧
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迅猛龙

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发表于 2016.5.9 16:23:36 | 显示全部楼层
Wuii 发表于 2016.5.9 12:23
主要原因是,,怎么都去不干净呗,运气不好
===========
达到30%的,那就是污染比较严重了

多的有50%呢。差异基因筛选的的时候用的fpkm值是基于read counts来算的吧。那rRNA 污染的样品的read counts 数就会因此少了很多吧?这样找出来的差异基因会不会影响?
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发表于 2016.5.9 18:10:09 | 显示全部楼层
zhouqian2617 发表于 2016.5.9 16:23
多的有50%呢。差异基因筛选的的时候用的fpkm值是基于read counts来算的吧。那rRNA 污染的样品的read coun ...

反正就是有效reads 达到基本要求
我觉得就只能这样了。
污染超过50% 直接让公司重新给你测吧
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发表于 2016.5.12 11:09:55 | 显示全部楼层
楼主,我想要中文版的看一下,想了解illumina 在RNAseq 过程中的建库过程,如strand SE 等具体操作 当然我也看了不少关于这个的文件,但总感觉之间有gap,连接不起来,而且经常会发生脑袋混乱。还有我想知道您那有没有raw data 的质控过程?我现在想对数据进行下过滤。对于接头的过滤有点困惑。
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钵水母

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发表于 2016.5.13 09:18:36 | 显示全部楼层
楼主提议不错,常规的建库我们会交给公司去做,但有些比较繁琐的我们还是会选择自己建库,确实需要有一个这样的交流平台。
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发表于 2016.5.14 11:05:32 | 显示全部楼层
说的很有道理。从我们公司自己走过的各种坑来看,很多后期分析遇到的问题,的确就是建库不理想导致。建库质量好,会规避很多问题。
新的一天加油!
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发表于 2016.5.20 13:45:04 来自手机 | 显示全部楼层
学习了。
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钵水母

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发表于 2016.6.27 15:59:11 | 显示全部楼层
不错,我是做建库实验的,可以交流些建库心得。对应用了解不够,学习了
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钵水母

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发表于 2016.6.29 18:06:12 | 显示全部楼层
yuzhe891 发表于 2016.5.8 22:01
不好意思,我回答不了你的问题,我没有想过这个问题。但是我觉得你的问题也没有问全。

首先,这个问题应 ...

建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠上,80%乙醇洗磁珠的过程没有将rRNA洗除干净。在后续建库的时候,rRNA也跟着反转录参与了建库。导致后期测序时引入了rRNA数据。
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钵水母

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发表于 2016.6.29 18:07:10 | 显示全部楼层
zhouqian2617 发表于 2016.5.8 21:14
有个问题,建库过程中rRNA污染是怎么来的,如何避免

建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠上,80%乙醇洗磁珠的过程没有将rRNA洗除干净。在后续建库的时候,rRNA也跟着反转录参与了建库。导致后期测序时引入了rRNA数据。
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迅猛龙

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发表于 2016.6.30 13:01:06 | 显示全部楼层
yuhan 发表于 2016.6.29 10:07
建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠 ...

谢谢解答
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钵水母

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发表于 2017.1.7 15:08:12 | 显示全部楼层
yuhan 发表于 2016.6.29 18:07
建库过程中rRNA污染主要是在oligo(dT)磁珠捕获mRNA的过程中引入的。有的rRNA会特异或非特异的结合到磁珠 ...

rRNA污染对差异基因的表达有什么影响吗?
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钵水母

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发表于 2017.1.7 15:11:41 | 显示全部楼层
rRNA如果全部参与被测序的过程,带来的影响是什么?
而且,在差异基因筛选时,用的是RPKM值,假如有的基因部分有点像,那得到的RPKM值会不会不准确?
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