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非模式生物研究怎么发单细胞文章?

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发表于 2020.6.2 09:50:43 | 显示全部楼层 |阅读模式
在上周的文章里,我们提到现在单细胞测序非常火,在各个研究领域都有单细胞忙碌的身影。目前10x Genomics单细胞转录组已发表的文章中,物种绝大多数还是人和小鼠(小鼠本质上还是服务于人类研究),但目前也已有其他物种的文章陆陆续续冒了出来。
今天就来盘点一下目前已发表的动物研究领域的10x单细胞转录组文章, 包括猕猴、猪、斑马鱼、果蝇、海鞘、蝾螈、线虫、疟原虫等,看看有没有你的研究领域和方向。还没搭上10x单细胞这趟早班车的抓紧时间。

图1 截至2020年5月,10X RNA-seq技术发文的分布(第二列为物种分布)

目前非人哺乳动物的研究,大部分都是围绕作为人类疾病研究的模式生物,而不是去研究该物种本身的特点(通俗的说,它们还都只是作为人类替身,还不是作为独立的角色登上研究的舞台)。目前被研究的非人模式生物包括:小鼠、大鼠、猕猴、猪。以猕猴为例,相比小鼠,毫无疑问猕猴与人类更相似,作为模型对疾病机制研究来说就是亮点。对有好材料的老师来说,比如弄个猴子自发成癌的模型,测出来就是好文章。不过也已经有新的趋势出现,即用10X RNA-seq技术去解析该物种自身的特点(而不是作为人类疾病模型)。比如,其中有一篇文章研究瘦肉型猪和脂肪型猪的肌源性细胞差异。

新生恒河猴在艾滋病病毒包膜免疫后具有不同的免疫细胞转录谱

题目:Neonatal Rhesus Macaques Have Distinct Immune Cell Transcriptional Profiles following HIV Envelope Immunization[1]
发表时间:2020
期刊:Cell reports

材料与方法:       
成年(n=3)和初生(n=3)猕猴接种HIV免疫原后第九周,取外周血单核细胞(PBMC)。

主要研究内容:
HIV-1病毒感染的婴儿比成人更快地产生广泛中和抗体,表明新生儿和成人对HIV-1包膜的反应不同。本研究中,HIV-1包膜免疫原三聚体在新生猕猴中比成年猕猴更快地引起gp120和gp41特异性抗体的增加。通过比较疫苗接种后新生猕猴和成年猕猴的PBMC单细胞转录组,发现新生猕猴的T细胞中凋亡调节因子BCL2的表达量更高,而在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和单核细胞中IL-10、 IL10RA的表达量下降。此外,免疫新生猕猴血细胞中激活的血液滤泡辅助T(Tfh)细胞的频率增加。因此,与成年猕猴相比,新生猕猴的血细胞转录组表现出低水平免疫抑制和细胞凋亡的特征,提供了有利于早期免疫的免疫环境。

图2 文章研究思路示意图

灵长类视网膜中央凹细胞和外周视网膜细胞的分子分类和比较

题目:Molecular Classification and Comparative Taxonomics of Foveal and Peripheral Cells in Primate Retina[2]
发表时间:2019
期刊:Cell

材料与方法:

从食蟹猴(一种猕猴)中采集了165,000个视网膜细胞,进行单细胞测序分析。这些细胞一大半来自中央凹,其余一半来自周围视网膜,以此对两个部位的细胞进行系统分型以及比较。

备注:
人类的视觉在哺乳动物中出类拔萃,需要视觉能够分辨极细微的差异,并能迅速对焦。高清视觉全得归功于视网膜中间一个极小的特殊区域——中央凹,也就是眼底黄斑的中心。中央凹的直径不到1.5毫米,面积只占视网膜的不到1%,但大脑获得的视觉信息却有50%来自这里。中央凹非常特殊,乳动物中只有部分灵长类生物进化出了这个结构,比如人类。而小鼠这样的模式生物,却没有这样的结构。所以,小鼠模型在研究人类视觉疾病的时候价值非常有限。与人类高度近缘的灵长类动物才能提供更多有效的信息。

主要研究内容:
作者一共鉴定出了超过70种细胞,其中超过60种细胞类型在两类区域(中央凹和周围视网膜)都存在,但是在细胞比例和基因表达上表现出差异。猕猴视网膜类型与小鼠视网膜类型的比较揭示了中间神经元是十分保守的。相反,视网膜神经节细胞在猕猴中存在特异性(某些细胞猕猴中有,但小鼠里没有)。在关键细胞类型和基因上,猕猴与人类是高度保守的。人类中190多个与7种人类视网膜疾病相关的基因,在猕猴视网膜亚群特异表达基因中可以找到同源基因。

短评:
这是一篇典型细胞图谱文章。但基于材料的特殊性(小鼠没有这个结构,人类样本几乎不可能收集到,猴子要收集这么多样本也很不容易),解决了重大的医学问题(模型小鼠无法解决的人类视网膜疾病机制研究),所以可以有很好的文章产出。所以材料特殊性本身就是核心竞争力。

图3 文章研究思路

单细胞RNA-seq和蛋白质组学联合分析猪骨骼肌发育的关键机制
题目:Association Analysis of Single-Cell RNA Sequencing and Proteomics Reveals a Vital Role of Ca 2+ Signaling in the Determination of Skeletal Muscle Development Potential[3]
发表时间:2020
期刊:Cells (注意,这不是顶级期刊那个cell,而是cells,其2019年的IF大概是5.7)

材料与方法:
      
从瘦肉型和脂肪型新生仔猪中,获得肌肉来源的细胞进行10X RNA-seq测序。

主要研究内容:
本研究旨在探索骨骼肌中肌生成和脂肪生成之间动态平衡的机制。相对于脂肪型猪,瘦肉型猪的肌源性肌系细胞的分化潜能显著增强,但其脂肪系细胞的分化潜能相似。10X RNA-seq分析发现,与脂肪型猪相比,瘦肉型猪在骨骼肌中保留了更高比例的肌系细胞。此外,瘦肉型猪的肌系细胞更接近肌源祖细胞的原始阶段。

蛋白质组学分析发现,两个品种之间肌系细胞的差异表达蛋白主要涉及肌肉发育、细胞增殖和分化、离子稳态、凋亡和MAPK信号通路。细胞内离子稳态的调节在两个品种的肌系细胞之间有显著差异。与脂肪型猪相比,瘦肉型猪的肌系细胞在细胞质和内质网中的钙离子浓度更低。综上所述,肌系细胞比例高、分化能力强是瘦肉型猪肌源性分化能力强、肌内脂肪沉积少的主要原因。相对低浓度的细胞钙离子浓度有利于肌系细胞保持强大的分化潜能。

简评:
这篇文章发的杂志影响因子虽然不算很高,但研究的主题已经脱离了模式生物研究的范畴,而是研究猪本身的重大特性——瘦肉型猪与脂肪型猪的差异。未来,非人哺乳动物的单细胞转录组还大有所为,毕竟每个物种都有自己的特点需要在细胞水平被进行解析。

图4 文章主要研究思路

鸟类

鸟类作为卵生动物,是研究胚胎发育很好的模型。另外,作为一种占据天空的高等动物,鸟类无疑还有很多特点值得深入研究。

单细胞转录组研究鸡胚性腺性别分化过程

题目:Insights into Gonadal Sex Differentiation Provided by Single-Cell Transcriptomics in the Chicken Embryo[4]
发表时间:2020
期刊:Cell reports

材料与方法:

目标组织为公鸡和母鸡左侧性腺组织,取样时间为性腺分化前(胚胎发育4.5天)、性腺分化中(胚胎发育6.5天)和性腺分化后(胚胎发育8.5天),分别开展单细胞转录组测序。

主要研究内容:
尽管物种间性腺性别分化的遗传触发因素不同,但性腺发育的细胞生物学长期以来被认为是高度保守的。单细胞转录组测序表明,与研究的其他脊椎动物相比,鸡胚胎支持细胞不是来自体腔上皮。相反,它们来自DMRT1+/PAX 2+/WNT4+/OSR1+间充质细胞群。研究发现性腺细胞类型比以前认为的更复杂,包括在发育中的睾丸组织发现两个不同亚群的支持细胞,以及从分化的支持细胞谱系中衍生出的胚胎类固醇生成细胞。总之,这些结果表明,正如不同脊椎动物的性别遗传触发因素不同一样,不同物种性腺中的细胞谱系分化也可能有很大差异。

图5 实验设计以及细胞分群

NF-κB信号调节鸟类视网膜中增殖的米勒胶质源性祖细胞形成
题目:NF-κB signaling regulates the formation of proliferating Müller glia-derived progenitor cells in the avian retina[5]
发表时间:2020
期刊:Development

材料与方法:  
      
用n-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)处理鸡视网膜,造成视网膜损伤。然后取对照组(不做损伤处理),NMDA处理后24h,28h和72h的鸡视网膜开展10X RNA-seq。

主要研究内容:
一些冷血脊椎动物有更强的视网膜再生能力,但在温血脊椎动物则失去了这一能力。理解抑制米勒胶质细胞重编程为神经原性祖细胞的机制是解析视网膜再生潜力的关键。炎症和反应性小胶质细胞影响米勒胶质源性祖细胞(MGPCs)的形成,但这种相互作用的机制尚不清楚。本研究用鸡体内模型研究了在米勒胶质细胞重编程为增殖祖细胞的过程NF-κB信号传导途径的变化。

研究发现,在神经元损伤或用生长因子治疗后,NF-κB途径受到米勒胶质细胞动态调节。抑制NF-κB信号通路会增强PGPCs的增殖。小胶质细胞去除后,NF-κB激动剂对MGPC形成的影响被逆转,表明反应性小胶质细胞提供的信号影响NF-κB通路对米勒胶质细胞重编程的调控。研究认为NF-κB是一个重要的信号“中枢”,它抑制米勒胶质细胞重编程为增殖的MGPCs,并且这个“中枢”协调来源反应性小胶质细胞的信号。

爬行两栖动物

爬行/两栖纲动物研究,目前比较关注的点是肢体再生(比如,我们熟悉的壁虎就会没事扔下自己的尾巴逃命,反正尾巴还能再长出来)。同时,爬行/两栖纲是古老的陆生脊椎动物,可以帮助我们追溯哺乳动物某些生理机制的进化源头。对于任何有自己特点的物种来说,10X单细胞转录组研究都大有可为。

蝾螈肢体再生

Single-cell analysis uncover sconvergence of cell identities during axolotl limb regeneration[6]
期刊:Science
发表时间:2018

材料与方法:

美西钝口螈(Ambystoma mexicanum)上肢截肢后五个时间点芽基和正常组织对照,及三个肢芽阶段结缔组织细胞和芽基细胞对照,进行10×Genomics单细胞转录组测序

主要研究内容:

美西钝口螈前肢的截肢会形成芽基,作为再生新肢体的祖细胞来源。结缔组织(CT)细胞是最为丰富的细胞谱系,有助于促进芽基产生。研究联合使用Cre-loxP报告基因谱系跟踪和单细胞RNA测序(scRNA-seq),来追踪CT细胞谱系的再分化轨迹及肢体再生过程中特殊谱系的分子重建步骤。结果显示,芽基细胞具有肢芽祖细胞特性,能形成多能CT祖细胞。进入诱导再生时CT细胞表达会失去成体表型,之后的阶段能够重现胚胎类肢芽表型。

图6  蝾螈单细胞测序示意图及亚群聚类可视化结果

爬行动物大脑屏状核及其在慢波睡眠中的作用
题目:A claustrum in reptiles and its role in slow-wave sleep[7]
期刊:Nature
发表时间:2020

材料与方法:
对成年雄性鬃狮蜥(一种蜥蜴)大脑中的端脑部位,进行单细胞转录组测序。一共检测了20,257个细胞,作者重点关注其中的4,054个大脑皮层谷氨酸能神经细胞。
备注:文章用到的小鼠和黄肚红耳龟数据来自前人的文献报道。

主要研究内容:
通过10X RNA-seq和病毒示踪识技术,研究人员发现在爬行动物鬃狮蜥中也存在屏状核(通过与小鼠单细胞转录组数据比较,发现鬃狮蜥存在与小鼠屏状核相似的细胞亚群)。在鬃狮蜥慢波睡眠期间,尖波主要的产生部位是屏状核。尖波以及叠加的高频波几乎传播到整个相邻的脑室脊背部(DVR)。屏状核的单侧或双侧病变分别以单边或双边的方式抑制慢波睡眠过程中尖波的产生,但不影响该物种睡眠特征和快速交替睡眠的频率。因此,屏状核不参与睡眠节律本身的产生。

轨迹示踪显示,爬虫类屏状核广泛地投射到包括皮层在内的各种前脑区域,并且它从中脑和后脑区域(已知的哺乳动物中参与其唤醒-睡眠调控的脑区)中接收信息输入。例如,周期性地调节屏状核中5-羟色胺的浓度,会导致尖波在屏状核以及附近的DVR产生相应的调整。通过分析另外一组单细胞转录组数据,研究人员还发现黄肚红耳龟(同样是爬行动物)中也存在屏状核。因此,屏状核是一种古老的结构,其可能早已存在于同祖先的脊椎爬行动物和哺乳动物的大脑中。屏状核可能在控制脑部状态中起重要作用。

短评:
非模式生物的细胞鉴定是个难点。通过跨物种单细胞数据比较(基于同源基因),可以充分利用模式生物的研究结果,去注释非模式生物细胞的类型。

图7 鬃狮蜥大脑皮层谷氨酸能神经细胞的聚类

今天的分享到这里告一段落,下一期我们再继续了解其他物种的单细胞转录组文章。

参考文献
[1]Han Q, Bradley T, Williams W B, et al. Neonatal Rhesus Macaques Have Distinct Immune Cell Transcriptional Profiles following HIV Envelope Immunization[J]. Cell Reports, 2020, 30(5).
[2]Peng Y, Shekhar K, Yan W, et al. Molecular Classification and Comparative Taxonomics of Foveal and Peripheral Cells in Primate Retina.[J]. Cell, 2019, 176(5).
[3]Qiu K, Xu D, Wang L, et al. Association Analysis of Single-Cell RNA Sequencing and Proteomics Reveals a Vital Role of Ca2+ Signaling in the Determination of Skeletal Muscle Development Potential. Cells. 2020;9(4):1045. Published 2020 Apr 22. doi:10.3390/cells9041045
[4]Estermann MA, Williams S, Hirst CE, et al. Insights into Gonadal Sex Differentiation Provided by Single-Cell Transcriptomics in the Chicken Embryo. Cell Rep. 2020;31(1):107491. doi:10.1016/j.celrep.2020.03.055
[5]Palazzo I, Deistler K, Hoang TV, Blackshaw S, Fischer AJ. NF-κB signaling regulates the formation of proliferating Müller glia-derived progenitor cells in the avian retina. Development. 2020;147(10):dev183418. Published 2020 May 22. doi:10.1242/dev.183418
[6]Gerber T, Murawala P, Knapp D, et al. Single-cell analysisuncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration[J].Science, 2018, 362(6413): eaaq0681.
[7]Norimoto H, Fenk LA, Li HH, et al. A claustrum in reptiles and its role in slow-wave sleep. Nature. 2020;578(7795):413‐418. doi:10.1038/s41586-020-1993-6



本文作者:基迪奥-周老师

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