查看: 1120|回复: 1

基迪奥客户文章:10X单细胞转录组+免疫组发文《Cell》

[复制链接]
  • TA的每日心情

    2020.6.3 17:02
  • 签到天数: 28 天

    连续签到: 1 天

    [LV.4]偶尔看看III

    管理员

    Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

    主题
    153
    奥币
    1465
    积分
    1328
    注册时间
    2019.7.8
    在线时间
    243 小时

    发表于 2020.4.23 09:54:36 | 显示全部楼层 |阅读模式
    2019年11月14日,广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所张玉霞研究员,国家临床重点专科儿科消化团队与北京大学白凡研究员团队合作在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell(《细胞》)以长文形式发表了题为“Mucosal profiling of pediatric-onset colitis and IBD reveals common pathogenic and therapeutic pathways”的研究论文,报道了儿童疾病研究领域的重大进展。基迪奥生物为该项目提供了10X genomics单细胞转录组标记、测序与售后服务。

    在之前的微信文章中,我们发过该篇文章的新闻稿。今天,我们将从数据分析的角度进一步对这篇文章进行解读。我们将解读这篇文章如何综合单细胞转录组、单细胞免疫组库、GWAS以及细胞/动物实验,来解析特定疾病发生发展以及药物治疗的机制。

    背景概要

    儿童期发病的结肠炎(Pediatric-onset colitis)和儿童炎症性肠病(pediatric inflammatory bowel disease, IBD)的发病率逐年增加,该类疾病反复发作、治疗无效率高且费用昂贵。中、重度结肠炎的发病年龄较PIBD普遍偏低,且发病率大幅高于PIBD,但目前仍不清楚儿童期结肠炎是否是导致PIBD及成人炎症性肠病的风险因素。

    广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心消化科杨敏主任医师发现PIBD患儿外周血血小板计数异常,应用抗血小板的传统药物双嘧达莫(商品名:潘生丁)对某些患儿有明显的治疗作用。但PIBD临床表现复杂及致病机制不清严重限制了治疗方法的选择和个性化诊疗的开展。

    为此,研究团队利用单细胞测序技术首先分析了对照组、结肠炎和PIBD各亚型间结肠黏膜的免疫与非免疫细胞的组成、转录特征及表达通路富集情况。结合全基因组关联分析(GWAS),研究团队进一步阐述了中国PIBD的易感基因、受累细胞亚型及可能的致病机制。

    随后,通过肠道免疫表型分析、体外细胞实验、体内动物实验证实胞内第二信使环状单磷酸腺苷(cAMP)的缺乏会导致肠道免疫微环境紊乱,主要表现为:肠黏膜富集大量的磷酸二酯酶4B(PDE4B)和肿瘤坏死因子α(TNFα)高表达的巨噬细胞;CD39在结肠上皮T淋巴细胞中表达下调;血小板在肠黏膜聚集并释放5-羟色胺(血清素)。

    在阐明机制的基础上,研究团队证实抗血小板药物双嘧达莫可以增加cAMP浓度,并在临床试验中取得了良好的治疗效果。本研究开拓了利用第二信使激动剂治疗儿童和/或成人结肠炎、PIBD、成人IBD以及其它胃肠道疾病的新领域,有望为家庭和社会节约大量医疗成本。

    作为一篇Cell文章,本篇论文的工作量是非常巨大的。其中单细胞测序以及数据的解析占据了最大篇幅。在本篇论文中,单细胞测序、传统的群体GWAS分析以及经典的分子生物学实验被完美融合在一起(如下图)。在单细胞数据的个性分析方面,也用到了我们总结的目标亚群定制分析的全部4类方法(下图C的分析点)。下面,就让我们一起来解析这篇文章的思路。

    文章研究思路

    为了便于大家理解,先附上一份免疫细胞全家福示意图

    1. 队列特征与单细胞转录组图谱(分群)

    (1)病例(队列)群体的特征分析

    既然是医学研究,必然涉及对典型的临床指标进行检测,这里也不例外。研究团队回顾了2016 ~ 2019年招募的306名患儿,并根据临床、生化检验、内镜和组织病理学等评分将患儿分为对照、结肠炎(colitis),溃疡性结肠炎(UC,PIBD的一种亚型)和克罗恩病(CD,同样是PIBD的一种亚型)组。结肠炎又分为轻(分级1)、中(分级2)、重度(分级3)三个等级。肠镜时,中-重度结肠炎及UC和CD患者的血红蛋白(HGB)和白蛋白(ALB)显著降低,而超敏C反应蛋白(hsCRP)和血小板计数则升高。

    (2)样本选择和队列分析

    为了阐述不同亚型病例的致病机制并寻找治疗靶点,研究团队对17名患儿(对包括对照组在内的四组取样,如下图A)的结肠黏膜进行取样测序。研究采用FACS方法分离免疫细胞和非免疫细胞,然后进行单细胞转录组及TCR+BCR测序(针对CD45+免疫细胞同时开展转录组和免疫组库测序)。

    单细胞测序结果将免疫细胞和非免疫细胞的数据合并分群,分群如下图(B)。从图中我们可以看出即包含了常见免疫细胞(包括:B细胞、T细胞、NK细胞、髓系细胞等),又包含了非免疫细胞(包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞)。

    在文章的后续部分,作者将对这些亚群中的上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞以及T/B细胞子亚群进一步进行分析讨论。

    图1 队列特征与结肠黏膜单细胞图谱

    (3)全基因组关联分析(GWAS)

    为了寻找PIBD的风险基因,作者基于210个病例和614个对照进行了全基因组关联分析,定位了244个与PIBD风险基因。这部分风险基因将与后续单细胞亚群特异表达基因进行比较,分析风险基因主要在哪类细胞中起作用。

    备注:关于gene based GWAS的原理可以查阅我们另一本书籍《重测序红宝书进阶》

    2. 上皮细胞子亚群分析:PIBD风险基因在哪些子亚群特异表达

    将上皮细胞分为了10个子亚群(图2A),值得关注的是其中有两个子亚群没有被鉴定。因为单细胞测序实际上无法保证每个亚群都可以被精确鉴定(可能是难以鉴定的新细胞或者低数据质量的细胞)。

    这里包含比较常规的单细胞子亚群分析。包括常规的讨论子亚群特异表达的基因(图2B)以及特异转录因子(图2C),以及上皮细胞中的干细胞进行拟时间分化轨迹分析(图2E)。结合这些单细胞子亚群分析结果,作者还讨论了PIBD风险基因(来源GWAS结果)在各个子亚群细胞以及分化轨迹中的表达情况(图2D、F)。比如CASP7特异表达与结肠上皮细胞(colonocytes),已报道可能引起肠上皮(coloncytes)凋亡;PIEZO1特异表达在Goblet细胞上,与激活的离子通道相关。
    通过这一步简单的分析,就实现了传统GWAS分析与单细胞转录组数据的关联。其潜在逻辑链为:

    1) GWAS分析得到基因风险基因。那么风险基因的作用机制是什么?
    2) 单细胞测序 → 某些风险基因在特定细胞中表达。
    3) 结合以上两点得出:风险基因潜在是通过影响特定细胞导致疾病。

    通过以上简单的逻辑,就打通了GWAS和单细胞转录组之间的关系。

    图2上皮细胞子亚群分析以及GWAS分析结果的关联

    3. 成纤维细胞以及皮细胞子亚群分析——儿童结肠炎及炎症性肠病结肠黏膜富集炎性成纤维细胞且血管生成增加

    分析得到结肠黏膜成纤维细胞共7个亚群以及和血管内皮细胞1个子亚群(图3A),分析得到8个子亚群特异表达的基因(图3B)。这些子亚群在4组样本里明显比例不同 (图3C)。值得注意的,这里作者不仅仅是根据前人报道的marker,也会根据子亚群特异表达的转录因子,潜在功能等信息来定义子亚群。

    例如, WNT2B高表达(Fibroblast-WNT2Bhi)子亚群。某些子亚群还有非常明显的病例偏好,例如其中炎性成纤维细胞几乎只在UC病例组中存在(图3C)。作者对于子亚群特异表达基因也进行了富集分析,并比较了通路中基因相比正常对照组的表达变化(图3D)。研究团队还发现疾病组的血管生成以及免疫细胞跨内皮迁移增加(图3E-F)。

    图3 PIBD与对照组的成纤维与内皮细胞组成与功能差异

    4. 髓系细胞子亚群分析——儿童结肠炎及炎症性肠病结肠黏膜富集高炎性髓系细胞

    髓系细胞在患者组中的比例显著要高于对照组(图4A)。髓系细胞全部可表达CD68,可以分为10个子亚群。通过亚群特异表达基因的pathway富集分析,作者定位了几个值得关注的核心通路(图4E),例如NF-kappa B signaling pathway, TNF signaling pathway等。

    这些细胞子亚群同样在不同样本组的分布不同,例如高表达IL1β和TNFα的巨噬细胞几乎只存在3类患者中,这类细胞中行使降解胞内cAMP功能的基因PDE4B(磷酸二酯酶)表达升高(用免疫荧光实验验证,图4F)。前人已经报道抑制PDE4B可以降低炎症因子的释放。作者通过体外细胞实验证实靶向PDE4B的临床药物双嘧达莫可以显著抑制TNFα,IL1β和IL6的释放(图4G-I)。

    图4 PIBD结肠黏膜富集炎性髓系细胞

    5. B细胞的子亚群分析——单细胞转录组以及BCR免疫组库分析

    作者对两类B细胞分别开展讨论和分析:组织驻留的记忆B细胞(可以转化为浆细胞)以及浆细胞(即效应B细胞)。相对对照组,作者发现CD19+ 记忆B细胞在结肠炎组比例显著上升,分化后的B细胞——CD138+浆细胞则在IBD组显著上升(图5A)。通过子亚群分类,CD19+ B细胞分为了7个子亚群,CD138+浆细胞分为了2个子亚群(图5B),同样也分析讨论了这些子亚群的关键标记基因(图5C)。对于B细胞,该研究同时进行了单细胞BCR免疫组测序。

    分析发现,在Brm-CD27lo, plasmablast(浆母细胞)和plasma cells(浆细胞)中BCR的克隆显著扩增(具有更多的BCR种类)。通过分析记忆B细胞和浆细胞共有的BCR种类所占比例,推测浆细胞的转化来源。分析发现大部分浆细胞是由Brm-CD27lo类型的记忆B细胞转化而来的(图5E)。在PIBD患者(UC和CD)组,lgG+ 浆细胞比例显著上升,这与之前报道lgG+ 浆细胞会促进PIBD病程发展一致(图5F)。最后,作者重点关注了浆细胞中在病例组高表达的与NF-kB激活相关的基因(图5G-H)。

    图5 B细胞子亚群转录组以及BCR分析

    6.T细胞、NK细胞的子亚群分析——单细胞转录组以及TCR免疫组库分析

    对于T细胞和NK细胞,一共又可以分为16个子亚群(图6A),作者同样整理了子亚群特异表达的基因(图6B),尤其是子亚群特异表达的转录因子(图6C-D)。类似B细胞分析,作者也分析了两大类T细胞(CD4+和CD8+)中TCR的多样性(图6E),以及通过分析不同类型T细胞共有的TCR,推测它们的转化关系(图6F)。

    值得关注的是,细胞表面表达的核酸水解酶CD39 (由ENTPD1编码) 在CD8+和Vδ1+T细胞的表达在PIBD各亚型中显著降低(图6G)。为了寻找与ENTPD1相关的基因,作者采用共表达分析的方法,发现GPR65, CD247 (编码TCR zeta 链),和MAP3K8 三个关键基因与ENTPD1表达正相关。

    GPR65是IBD风险基因,该基因内的1个突变可以导致炎症条件下在低PH环境中cAMP浓度的降低。MAP3K8可以调控ERK激活下游的TCR和TNF-α途径。也已经有报答IBD风险突变会导致MAP3K8表达降低。对CD8+和Vδ1+T细胞之间差异表达基因进行pathway富集分析,可以富集到PKA和ERK通路。这些分析证据都指明了对于患者T细胞的异常与cAMP通路相关。

    CD39受cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB调控(图6H),可以降解胞外的ATP和ADP。研究团队证实CD39表达缺失确实会导致肠黏膜ADP浓度增加,从而激活血小板促进5-羟色胺的释放,最终诱导黏膜损伤。也通过体外细胞实验证实了靶向PDE4B的临床药物双嘧达莫可以提高Navie CD8+T细胞的CD39表达(图5I),这与单细胞转录组分析及过往报道提示提高cAMP可能促进CD39的表达相符。

    图6 T细胞/NK细胞转录组以及TCR分析

    7.  双嘧达莫在防治儿童结肠炎及炎症性肠病方面的应用前景

    以上单细胞研究已经表明,PIBD在细胞水平呈现渗透高炎症巨噬细胞和树突状细胞,CD39+ T细胞 缺陷和血小板聚集,cAMP应答途径可能是这些缺陷背后的关键通路。为了证实靶向药物双嘧达莫是否可以改善肠炎症状,研究团队利用腹腔注射双嘧达莫的方式对硫酸葡聚糖(DSS)诱导的急性肠炎小鼠进行了治疗,发现双嘧达莫可以显著改善小鼠的体重、结肠长度和结肠的组织病理结构,抑制小鼠结肠黏膜的血小板聚集和TNFα的释放(图7A-D)。

    对9例患儿(8例结肠炎和1例未定型PIBD)开展了双嘧达莫的小样本临床试验,发现患者的血小板计数,结肠镜评分和临床综合评分均有明显改善(图7E)。其可能的机制是双嘧达莫通过cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB途径提高CD39的表达,从而抑制血小板的聚集和活化(图7F-G);同时,该药可以抑制CD68+髓系细胞及TNFα的释放(图7H),最终缓解临床症状。
      
    图7 双嘧达莫在临床上可以缓解结肠炎

    总结

    本研究揭示了结肠炎和炎症性肠病患儿肠黏膜多个细胞亚型中的cAMP通路被抑制,从而导致级联免疫紊乱并最终促进了PIBD的发生发展。本文还发现了胞内第二信使激动剂双嘧达莫可以提高cAMP,增加CD39的表达,抑制炎性因子分泌和血小板活化,从而为儿童结肠炎及炎症性肠病的防治开拓了新的领域。

    值得关注的是本研究中对单细胞测序(转录组和免疫组)、全基因组关联分析(GWAS)、分子生物学验证(细胞、动物实验和临床测试)等不同技术的贯穿应用。以上三大类研究工具,任何两个都可以两两进行组合使用,实现优势互补(如图7)。例如,GWAS分析虽然可以找到疾病相关的易感基因,但却难以回答易感基因的突变主要影响了哪些细胞以及哪些基因通路。而单细胞转录组测序,虽然可以回答各类细胞中都发生了基因表达调控网络发生了哪些变化。

    但是,基因表达调控网络是上下游存在相互反馈调节的系统,单凭转录组数据我们无法判定基因表达网络异常的源头是在哪里。而单细胞测序和GWAS的结合,则可以让两者优势互补,帮助回答单一技术无法回答的问题。

    由于本研究的核心点落脚于患者肠粘膜免疫细胞的异常。因此对免疫细胞尤其是T细胞进行了非常精细的解析,并最终将疾病相关核心通路锁定在cAMP通路,而这一通路与治疗药物双嘧达莫治疗机制也完成吻合。但研究需要对免疫细胞进行精细解析的时候,平行进行单细胞转录组测序和V(D)J免疫组测序无疑是非常高性价比的选择,可以为免疫细胞研究增加不少分析的亮点。

    图7 本文章中的三类研究技术的互补关系

    如今,面对愈加精细数据挖掘产生的大量个性分析,基迪奥也推出了10X单细胞转录组在线分析平台(www.omicsmart.com),让数据挖掘更加简单。需要做10X单细胞测序的老师可以联系我们开展相关项目。

    本文作者:基迪奥-周老师

    本帖子中包含更多资源

    您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

    x
    新的一天加油!
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2020.6.18 16:50
  • 签到天数: 43 天

    连续签到: 1 天

    [LV.5]常住居民I

    中华鲟

    Rank: 5Rank: 5

    主题
    0
    奥币
    491
    积分
    717
    注册时间
    2020.1.16
    在线时间
    19 小时

    发表于 2020.4.23 16:26:46 | 显示全部楼层
    这篇厉害
    回复

    使用道具 举报

    您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

    本版积分规则

    快速回复 返回顶部 返回列表