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拿到单细胞转录组数据一脸懵逼,要怎么分析细胞异质性?

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发表于 2020.4.15 10:38:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
近年来,单细胞转录组的热度居高不下,在越来越多的领域被应用。那么,有人就会问,单细胞转录组到底能做什么?可能很多人都会想到两个词——“去平均化效应”和“异质性”。本质上来说这两个词代表了单细胞转录组同一个功能,正是单细胞转录组的去平均化效应使得细胞异质性分析成为可能。

细胞异质性分析是单细胞转录组最基础也是最重要的分析内容。无论是进化发育,还是病理病程,亦或是生物耐受,都是从细胞异质性出发,进而深入探讨某些细胞群体的功能或与表型的关联。

今天,我们就借用一篇nature neuroscience的文章来解析细胞异质性分析在单细胞转录组的应用思路。这篇文章充分应用了细胞再分群和亚群上调基因分析,解析了下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area, LHA)中兴奋性神经元和抑制性神经元的异质性体现,并对其中的重要细胞群体做了功能性分析。

图1 文章标题

研究背景

大脑是脊椎动物最重要也是最复杂的器官;其复杂性体现在两点——神经网络庞大和细胞异质性强。大脑的任何组织都由多种类型的神经细胞、支持细胞和营养细胞等构成,并以此为基础形成辐射全身的神经、内分泌调控网络。所以,在单细胞技术出现后,大量解析大脑细胞异质性的文章也随之发表。

本文的研究对象LHA的主要功能是产生饥饿和饱腹感,控制生物的睡眠和觉醒;该区域的细胞异质性强且一直未得到充分解析。于是,本文分离LHA制备单细胞悬液,进行了单细胞转录组测序,利用对目标亚群的再分群分析逐步解析了谷氨酸能神经元(LHAGlut,兴奋性神经元)和氨基丁酸能神经元(LHAGABA,异质性神经)的异质性,并深入探讨了表达Sst蛋白的神经元的功能和兴奋途径。

研究思路

图2 文章研究思路

研究结果


1、细胞亚群鉴定

单细胞转录组的初始分群结果是基于细胞相似性的无监督分群结果,不具备生物学意义。所以,单细胞转录组分析的第一步永远是细胞亚群鉴定,赋予细胞群体生物学意义。

本文对细胞亚群的鉴定是层层递进的,首先以神经细胞的marker基因将所有细胞首先划分为神经细胞和非神经细胞;然后,非神经细胞依据不同的marker基因又被进一步鉴定为13种细胞类型,神经细胞依据合成谷氨酸和氨基丁酸的必要基因Slc17a6和Slc32a1进一步区分为兴奋性神经元和异质性神经元。文章后续对所有神经细胞进行深入异质性分析。

图3 细胞亚群鉴定结果

2、目标亚群细分

单细胞转录组之所以可以进行细胞异质性分析,其中一个重要原因便是文库构建时对细胞的无差别捕获,在最终获得的测序数据中几乎包含了组织中所有细胞类型。所以,对目标亚群进行再分群是细胞异质性分析的重要内容。

文章的主要研究对象是神经细胞,所以分别对兴奋性神经元和抑制性神经元进行再分群,分别获得了15个细胞亚群。这些细胞亚群本身作为子亚群,故而使用了每个细胞亚群的基因表达模式来进行了命名。

图4 LHAGlut和LHAGABA细胞再分群结果

而其中的特殊细胞亚群又具有更进一步划分子亚群的可能性。这类特殊细胞亚群一般具备如下特点:

1) 细胞亚群表达个人比较感兴趣的基因。这类细胞亚群的个性化很强,依据研究者及其实验室的研究而定,在这里我们不做过多的介绍。

2) 细胞亚群表达的基因与表型相关性较高。这类细胞亚群对表型解释力较高,对它们的异质性分析既有助于挖掘出关键基因,也能提高文章深度。在这篇文章中,作者选择了表达Hcrt和Pmch的细胞亚群做进一步的亚群细分,因为这两个基因的具有调节食物摄取量和睡眠的功能,与LHA的生物功能吻合。

3) 细胞亚群表达的基因功能解释不明。这类细胞亚群往往就和文章创新性挂钩。在这篇文章中,作者挑选了表达Sst的细胞亚群来做再分群和深入分析,因为Sst作为激素的功能研究比较透彻,但是因为LHA的高度异质性,Sst作为神经肽的功能尚不明晰。作者关于Sst细胞群体的功能解析为文章增色不少。

3、特征基因分析

在单细胞转录组分析过程中,细胞再分群功能获得了若干细胞亚群,而解析这些细胞亚群的功能才是异质性分析的重点。细胞功能又往往与基因表达特征相关,所以,细胞亚群的特征基因分析成为异质性分析的重要分析内容。

特征基因分析主要借助细胞亚群上调基因进行,文章的呈现方式主要有两种:

1) 广泛的表达特征描述。任何一篇文章都不可能针对所有细胞亚群做深入研究,最终的成文结构必然“有点有面”。而对所有细胞亚群的广泛的表达特征描述就属于“面”的文章内容。在这篇文章中,作者针对兴奋性神经元和异质性神经元的所有细胞亚群做了系统的描述,并以小提琴图的方式展示了基因特征。

图5 LHAGlut和LHAGABA各亚群基因表达特征

2) 重点的表达特征分析。这一部分就属于“点”的文章内容,针对目标亚群做重点分析,包括特殊基因表达情况、功能富集分析和后续的分子实验。在这篇文章中,作者便是挑选了Sst+细胞亚群做了深入分析。

4、实验验证

对于一篇优秀的文章而言,分子实验是不可或缺的,经过了分子实验验证的组学结果更加具有说服力。在这篇文章中,作者使用FISH验证了各亚群的基因表达特征,使用cre-loxp体系验证了Sst+细胞群体的提高生物活动性和摄食欲望的功能及神经传递网络。

总结

纵然单细胞转录组发展了这么久,但是细胞异质性分析依然是各研究领域的重点研究内容,而这一类文章的发文高度也是各有不同。研究简单的可以发一篇5分左右用于毕业,研究深入的可以发20+分的文章提高学术水平。不同于其他高分文章,细胞异质性分析使用到的数据分析思路套路很明确,其发文高度主要取决于文章的广度、深度和创新性。

这类文章的分析难度不大但是过程繁复,涉及的相关理论和软件使用在omicshare课堂中都有相应课程以供学习。
在线课堂地址:https://www.omicshare.com/class/home/index/series?id=44

但是,你是否会觉得R语言的学习太难了?本周三(4月15日)下午16:00,我们将基于omicsmart在线报告体系再现数据分析思路,欢迎感兴趣的老师同学扫码加群,等待直播通知~



本文作者:基迪奥-L.L

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钵水母

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发表于 2020.4.19 15:01:14 | 显示全部楼层
希望这样的文章讲解多一些代码附在下面
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钵水母

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发表于 2020.4.19 21:22:07 | 显示全部楼层
谢谢
开心了
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