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客户高分文章超详解——水稻杂交不育机制的深入探索

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    发表于 2020.2.20 09:50:03 | 显示全部楼层 |阅读模式

    合作单位:华南农业大学
    发表期刊:Nature Communications (12.35)

    转录组分析研究杂交水稻杂交不育的机制

    前言

    转录组测序是常见的测序分析手段,通过转录组测序分析,我们可以得到不同品种或不同组织之间的差异表达基因,并通过富集分析找到富集通路中的关键基因。但是,如何利用转录组分析发一篇NC的文章,就是值得探索的事情了。

    在该文章中,作者首先提出了一种杂交不育模型,杀死保护模型,并且对该模型的机制进行研究。之后将该模型中杂种不育关键位点进行转录组测序分析,明确了引起配子败育的生化过程。最后探讨了该模型是如何进化来的。文章内容一环扣一环,逐步进行分析,针对杂交不育的一个位点进行深层次的挖掘。

    基迪奥具有丰富的建库、测序和生物信息服务经验,为该项目提供了专业高效的转录组分析和差异基因表达通路方面的研究,协助客户找到了影响配子败育方面的重要途径,以求通过高质量的专业服务助力合作客户实现持续的高分文章产出。如有需求,可以与当地销售联系。

    研究背景

    杂种不育(HS)是合子后生殖隔离的主要机制之一。S1是一个典型的单位点HS基因座,可以影响非洲和亚洲水稻杂交后代。在这些亚非水稻杂交种中,携带亚洲水稻S1等位基因(S1-s)的雄配子和雌配子败育,导致非洲水稻S1等位基因(S1-g)具有很强的优先传导性。在S1-g处的S1TPR基因是介导S1 HS所必需的基因。S1TP(S1-s处)是S1TPR的等位基因,由于单核苷酸突变使S1TP过早终止,从而长度短于S1TPR。除了S1TPR外,S1-g区域还含有6个非洲水稻特异性基因S1A1-S1A6,其中S1A2-S1A6在花药和幼穗中具有转录活性。

    Tips:
    NIL-g:S1-g基因的近等基因系,除了S1位点为S1-g基因外,其他遗传背景均与轮回亲本PR-相似。
    RP-s:轮回亲本,S1位点为S1-s基因的自交系。轮回亲本是在回交过程中,一直为母本的自交系。
    等位基因:一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因。

    实验取材

    在不同时期,对近等基因系(NIL-g)、轮回亲本(RP-s)及其F1植株的花药,共6个样本进行转录组测序。

    研究思路

    该文章的研究思路其实很简单,一共只有三步:
    (1) HS杀死-保护模型机制的研究;
    (2) HS系统S1位点的转录组分析;
    (3) 杀死-保护模型进化起源的探索。
    但是每一步,作者都进行了大量的研究,最终只为解释清楚种间杂交水稻S1位点杂交不育的机制。

    图1:研究思路

    结果解读

    特异性S1组分S1A4和S1A6对HS的影响


    为了研究S1A2-S1A6是否参与了S1 HS,作者使用CRISPR/Cas9在NIL-g(携带S1-g的近等基因系)中分别对S1A2-S1A6进行了敲除。作者假设如果S1 HS需要一个特定的基因,使用敲除过S1A2-S1A6的NIL-g与RP-s杂交时则不会显示HS。

    结果显示,当这些突变体与RP-s杂交时,含有s1a2、s1a3或s1a5的突变F1植株是半不育的(约50%不育花粉粒和小穗);而含有s1a4和s1a6等位基因的突变F1植株完全可育。结果说明S1A4和S1A6是引起S1位点HS的影响因子之一。

    S1A4-S1TPR-S1A6构成的杀死-保护模型

    确定S1A4和S1A6是影响亚非水稻杂交不育的基因,作者为了研究S1A4、S1TPR和S1A6三基因组合是否可以使配子败育,作者用包含这三种基因的不同组合模式对RP-s进行了转基因转化。

    所有经过单基因(S1TPRt、S1A4t或S1A6t)或双基因(S1A4-S1A6t、S1TPR-S1A6t或S1A4t-S1TPRt)半合子状态转化的植株,均未表现出花粉和小穗半不育的表型(图2b、c)。而在纯合S1A4-S1A6t和S1TPRt系杂交将三个转基因组合在一起时,F1转基因植株的花粉和小穗是半不育的(图2d)。该结果表明,S1A4、S1TPR和S1A6构成一个杀死系统。

    图2 转基因植株的育性研究

    作者进一步分析了S1A4-S1A6t和S1TPRt转基因的分离情况。结果显示,S1A4-S1A6t和 S1TPRt杂交的F1是半不育的。此外,在F2个体中,S1A4-S1A6t的分离率与1:2:1,但S1TPRt的分离严重扭曲(只存在纯合S1TPRt或半合体S1TPRt-)。表明,S1A4-S1A6t与S1TPRt不连锁且S1TPRt分离扭曲并不影响正常的S1A4-S1A6t分离。所以作者推测,S1A4、S1TPR和S1A6在孢子体中共同作用,产生不育信号,杀死雄性和雌性配子。

    但只有S1TPRt存在时就可以保护相应的配子(无论是否有S1A4-S1A6t),从而挽救了携带S1TPRt的配子,导致F2代中有利于S1TPRt的严重畸变分离,但不影响S1A4-S1A6t的分离。

    为了验证这个假设,作者将S1TPRt与NIL-g杂交产生F1(S1-gS1-s/S1TPRt-)单株,该F1在孢子体组织中含有S1-g等位基因(因此应该激活HS),但在配子中会分离出S1TPRt。结果显示,S1位点杂合且缺少S1TPRt基因的F1和F2植株是半不育的。相反的携带S1TPRt基因,在S1位点杂合的F1和F2植株的花粉和小穗的受精率提高到约75%。并且,纯合S1TPRt的S1杂合子完全可育,表明S1TPRt允许携带该基因的S1-s等位基因的存在(图3)。这表明S1TPRt确实以配子体的方式保护了含有S1-s的配子。


    图3 S1TPRt与NIL-g杂交产生的F1和F2植株的育性

    基于以上的结果,作者提出了S1A4-S1TPR-S1A6杀死-保护模型。在S1TPRt×NIL-g的F1植株(S1-gS1-s/S1TPRt)中,S1-g等位基因在孢子体细胞中产生不育信号。由于内源性S1TPR的存在,保护所有含S1-g的配子,使其都存活了下来;但是S1-s的配子除非携带S1TPRt基因,否则都会败育。

    S1 HS系统的转录组分析

    为了确定导致配子败育生化过程有哪些,探索其发生的机制,作者对RP-s、NIL-g及其F1杂交后代的花药(小孢子母细胞期到减数分裂期)进行了转录组测序。NIL-g和F1与RP-s相比,包含250个上调基因和74个下调基因(图4a)。

    对这些基因进行KEGG富集分析,结果显示参与光合作用和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸(支链氨基酸,BCAA)降解的基因表达水平在NIL-g和F1植株中明显高于RP-s植株(图4b)。进一步利用qRT-PCR进一步验证了这些参与光合作用和BCAA降解的差异基因表达谱。该结果表明,光合作用和BCAA可能与配子发育有关。

    根据转录组测序分析结果,在BCAA降解途径中有6个基因在RP-s植物中表达水平明显低于F1和NIL-g(图5红框、图6)。由于功能失调的BCAA可以导致雄性和雌性配子败育。因此,作者认为三种S1-g基因产物的复合物可能会导致F1和NIL-g植株中BCAA的过度降解,从而产生影响配子发育的不育效应。在S1-g型配子中产生的S1TPR可能通过其肽酶功能促使BCAA维持正常水平。

    缺乏S1TPR功能的(F1携带S1-s)配子由于缺乏BCAA而不能恢复生育力。在亚洲水稻 (S1-sS1-s)中,参与BCAA降解的基因表达水平较低,使配子有足够的BCAA继续发育。

    图4 不同基因型花药的转录组分析和KEGG富集分析

    图5 KEGG数据库中BCAAs的降解途径

    图6 BCAA降解相关基因的表达分析

    S1配子杀死-保护系统的进化模型

    为了研究S1位点的进化,作者使用S1TPR、S1TP、S1A4和S1A6核苷酸编码序列,利用GenBank数据库对禾本科植物序列中同源的序列进行BLAST搜索,并构建了候选基因的系统发育树(图7)。下一步,作者对AA染色体和非AA染色体水稻基因组中进行S1TPR、S1TP、S1A4和S1A6序列的鉴定。结果发现在非AA基因组水稻中只存在S1TPR和S1TP,没有S1A4和S1A6序列。作者推测S1A4和S1A6可能是在AA基因组水稻中新近进化而来的。

    图7 S1位点S1TPR(TPR)同源基因的系统发育树

    为了验证S1位点的进化模型,作者对S1TPR和S1TP序列进行比对,发现两个序列之间存在7个SNP位点。针对这7个SNP位点对443个AA基因组水稻进行分析,结果显示在AA基因组水稻中存在两种SNP模式。一种是在1、3、4、6、7位点包含至少15个等位基因的S1TP模式(亚洲稻);另一种是在2、5位点包含4个等位基因的S1TPR模式(非洲稻)。亚洲稻和非洲稻之间S1TPR和S1TP等位基因的非自然重叠变异表明,至少有两个独立的谱系是从携带S1TPR基因的共同祖先谱系进化而来的(图8)。

    图8 S1TPR基因的进化轨迹

    之后作者进一步发现澳大利亚野生稻中存在S1A4-S1TP、S1A6-S1TP或S1TP结构;在非洲野生稻(非洲稻的祖先)中存在S1A4-S1TPR、S1A6- S1TPR或S1TPR结构。因此作者得出结论,包含S1TP和侧翼基因S1A4和/或S1A6(S1A4-S1TP,S1TP-S1A6,S1A4-S1TP-S1A6)可能首先在澳大利亚野生稻中出现,然后出现携带S1TPR的双基因中间结构(S1A4-S1TPR和S1TPR-S1A6)和最终出现功能性S1A4-S1TPR-S1A6复合体。

    文章小结

    在该研究中,作者提出了S1A4-S1TPR-S1A6构成的杀死-保护模型。该模型显示,在亚非水稻杂交种(S1-gS1-s)中,孢子体组织中S1TPR-S1A4-S1A6相互作用向雄性和雌性配子产生败育信号。

    S1TPR可以保护S1-g配子使其可育,而S1-s配子由于缺乏S1TPR而选择性败育。进一步对S1位点进行转录组分析发现,S1A4-S1TPR-S1A6三基因复合物是通过促进BCAA过度降解影响配子发育,使其产生不育效应。而S1TPR基因可以通过其肽酶的功能促使BCAA维持正常水平,保护S1-g型配子可育。

    最后作者对S1位点的进化模型进行了分析。该研究针对S1位点进行转录组测序,挖掘出与配子发育相关的基因,深入探究了可能影响配子败育途径。将S1位点的转录组测序、杀死-保护模型和进化模型相结合,阐明了水稻种间杂交不育的机制。

    在这篇文章中我们可以看到,作者利用多种研究方法(基因敲除、配子体研究、育性研究、SNP位点研究等)和转录组测序相结合,只为解释清楚S1位点杂交不育的机制。抓住一个点不放,进行深入的研究,也是一种发高分文章的思路呀!

    参考文献
    Y. Xie, J. Tang, X. Xie, X. Li, J. Huang, et al., An asymmetric allelic interaction drives allele 1437 transmission bias in interspecific rice hybrids. Nature Communications 10(1):2501 (2019).


    本文作者:基迪奥-小张张


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