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发表于 2019.10.16 11:47:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
​m6A甲基化是继DNA甲基化和组蛋白修饰之后的又一表观研究热点。MeRIP-seq (Methylated RNA Immunoprecipitation,也称作m6A-seq)目前是m6A甲基化的主要研究技术。在新技术刚刚出现的时候,往往很容易发表高分文章,m6A作为相对较新的研究领域必将大有可为。

作为一家做促销很“克制”的公司,为了助力大家发表高分文章,基迪奥现推出m6A-seq促销优惠活动,只需填写相关项目信息,即可报名。

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活动最终解释权归基迪奥生物所有

在看完上面的活动信息,你可能会问那么该如何开展m6A研究呢?下面以植物为例,结合具体文章为大家介绍m6A修饰的研究方案。

植物m6A修饰研究方案

转录组m6A甲基化是继DNA甲基化和组蛋白修饰之后的又一重要的表观修饰研究,已经被证明与植物的多种生理行为有关,是现阶段植物表观领域的热点研究(图1)。当前植物领域转录组m6A甲基化修饰的研究处于窗口期,大量植物转录组甲基化修饰的形成机制尚未被发现,是开展研究的好时机。

在之前的文章推送(戳这里)中,周老师为大家介绍过了m6A研究的核心逻辑,那么具体到植物的研究上目前的主流研究思路是什么样的呢?经过文献调研,我们总结了植物m6A研究的三种思路(图1):

1.全局研究m6A甲基化修饰
这种思路常出现于物种的初期研究,研究内容为不同时期、组织、性状的植株m6A修饰差异。关注点是peak(即甲基化富集区域)的分布以及peak相关基因信息。

2.研究m6A的形成机制
针对不同性状进行转录组测序,找到差异表达的基因,最后找到与甲基化相关的酶基因(酶基因也可以通过同源比对搜索等方式找到),敲除候选酶基因进行MeRIP-seq(也称m6A-seq)测序,验证酶介导甲基化修饰的功能。这种思路在当前植物m6A研究中最为普遍。

3.研究m6A修饰的作用机制
通过MeRIP-seq初筛找到peak相关基因,通过RNA-seq找出差异表达基因,将二者关联,最终找到m6A修饰导致基因表达差异的作用机理。这种思路是未来植物m6A研究的大趋势,当前该思路的文章较少。

图1 植物m6A研究三种思路


当前主流的植物m6A文章以形成机制的研究为主,从影响m6A修饰的甲基化相关酶入手,MeRIP测序研究目标酶基因对m6A修饰形成的影响,通过差异甲基化修饰基因富集分析找出差异基因,之后配合系列分子实验进行机制的验证。接下来,我们用一篇近期的文章为大家介绍植物m6A研究的常规分析思路:



水稻m6A甲基转移酶部件OsFIP调控水稻孢子生长的研究
发表时间:2019年5月
发表期刊:PLOS Genetic(IF=5.224)


一、研究背景
真核生物mRNA中最广泛的甲基化修饰是m6A修饰,修饰数量占所有RNA甲基化修饰的三分之二以上,m6A修饰对mRNA具有非同一般的意义。m6A的形成需要甲基化转移酶复合物的参与,在哺乳动物上许多蛋白(如:METTL3蛋白、METTL14蛋白、WTAP蛋白等)已经被证明参与了m6A修饰过程。

通过与动物甲基化转移酶相关蛋白同源基因搜索比对,在植物拟南芥中找到几类同源蛋白基因(MTA、AtFIP37)被证明参与拟南芥的m6A修饰过程。作为单子叶植物,水稻的m6A修饰机制与参与m6A形成的相关蛋白还未被了解,因此作者开展了水稻m6A研究。

二、实验取材
设置对照组和FIP敲除组,取两个时期的稻穗(每个样品稻穗数>20):减数分裂期(2–5 mm小穗)、早期孢子期(7–8 mm小穗),每组两个重复。进行m6A-seq测序。

三、研究思路
图2 研究思路

四、结果解读

1.水稻m6A甲基转移酶鉴定

通过同源比对搜索,找到5个水稻中与哺乳动物、拟南芥甲基转移酶同源的蛋白基因:OsMTA2、OsFIP、OsMTA1、OsMTA3、OsMTA4。

为了验证这五个蛋白质是否是水稻中m 6 A RNA甲基转移酶的亚基,分别建立基因敲除模型进行Dot blot 实验分析总体m6A水平,结果发现敲除OsMTA2、OsFIP后总体RNA的m6A水平出现降低,过表达对应蛋白m6A修饰水平出现升高(图 3),该结果说明了水稻m6A修饰需要OsMTA2、OsFIP两种蛋白的参与。

敲除候选基因OsFIP后,水稻出现不育的现象(图4),深入研究后发现缺失OsFIP后水稻花粉显著减少,结果暗示OsFIP通过影响m6A修饰的形成从而影响水稻的花粉正常发育过程。


图3 Dot plot检测敲除候选基因后总体RNA的m6A修饰程度


图4 敲除候选基因后的水稻性状变化


2.水稻缺失OsFIP基因后m6A修饰差异

通过MeRIP测序发现,对照组野生型花药在PMS时期(花粉母细胞期)和EMS时期(早期孢子期)分别检测到1909和568个peak,高于敲除OsFIP基因后检测到的112和49个peak数目(P<0.01),该结果说明孢子形成过程中大部分m6A修饰的形成依赖于OsFIP蛋白(图5B)。

通过motif检测发现:野生型水稻在孢子形成期motif “UGWAMH” (W = U or A; M = C or A; H = U, A or C)表达显著高于OsFIP敲除组,该motif与水稻其他生长阶段、其他部位常见的motif不同,表明水稻孢子发生过程中对m6A修饰位点的识别可能不同于其他发育阶段(图5C)。此外还发现,水稻m6A修饰集中在3’UTR区域,与其他生物报道相符(图5D),说明转录组m6A修饰具有一定保守性。



图5 MeRIP检测敲除OsFIP基因后m6A的修饰情况


3.差异甲基化基因富集分析及验证

对野生型与OsFIP敲除后m6A修饰差异基因进行GO富集分析,结果显示苏氨酸蛋白酶以及NTP酶相关基因被富集(图6)。差异表达的苏氨酸蛋白酶以及NTP酶相关基因在敲除OsFIP后在PMS时期(花粉母细胞期)和EMS时期(早期孢子期)表达量出现不同程度的上升(图7 A),通过qRT-PCR进一步证实了这些基因表达的差异(图7B)。之后,作者通过敲入苏氨酸蛋白酶基因等分子实验进一步验证了该机制。

由以上结果作者得出结论:OsFIP为水稻转录组m6A修饰的重要部件,它能够通过负调控苏氨酸蛋白酶以及NTP酶相关基因的表达介导水稻m6A修饰的形成,从而影响水稻孢子的正常发育过程(图8)。


图6 差异m6A修饰基因GO富集分析结果

图7 苏氨酸蛋白酶、NTP酶基因敲除OsFIP后的差异表达


图8 研究模型


文章总结

从这篇案例文章不难看出,当前植物m6A修饰的研究有着一定的“套路”:先从其他研究相对成熟的物种入手(如拟南芥、番茄、人等),通过与已知的甲基转移酶基因同源比对搜索参与m6A修饰的候选基因,将未知的问题转化为已知的问题。

之后,通过设置敲除组与对照组,进行MeRIP测序,检测差异m6A分布,验证候选基因对m6A修饰的影响,之后配合系列分子实验进行机制的验证,就完成了一篇植物m6A研究框架。

工欲善其事,必先利其器。m6A的研究顺利开展离不开高通量测序的辅助,本文(包括目前主流文章)中使用到了MeRIP测序技术进行m6A修饰研究,MeRIP-seq是m6A甲基化的主要研究技术,它能全面探讨表观调控对植物分化过程、抗逆机能、成熟发育等影响。

基迪奥生物正式推出基于MeRIP测序的转录组m6A研究方案,既可用于单个组学开展研究不同材料之间的甲基化全局差异,也可以结合转录组数据,深入探讨甲基化形成机制以及甲基化功能影响两大方面。

基迪奥m6A研究的4大分析板块


基迪奥生物推出的m6A修饰研究方案有如下特点:

1. 严格的质控流程:无论从实验还是数据分析,都有严格的质控过滤流程,尽可能保证数据的正确性和可靠性,为精确定位peak区域、筛选重要调控基因打造良好基础。

2. 完善的分析流程:根据多年项目经验,精心优化并打造整套完善的分析流程。分析内容涵盖质控、甲基化peak寻找、motif分析、差异甲基化分析、甲基化基因分析等30几项分析内容,满足绝大部分科研需求。

3. 全面的研究方案:既可单组学开展研究,宏观了解植物性状变化的表观机制;也可以结合已有转录组数据,开展多组学研究,深入探讨表观影响的分子机制。大、小文章全面兼顾。

技术介绍完了,大家是否对m6A-seq更加期待了呢?那么,赶紧回到文章开头扫二维码参与m6A-seq的免费活动吧!


本文作者:基迪奥-阿拉雷

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