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追求前沿,不忘本源——9月客户文章分享

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发表于 2019.10.14 14:52:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
测序技术蓬勃发展了三十余年,已经接着一二代技术“没完没了”的发展出了Pacbio SMRT三代测序,Hi-C三维基因组学技术。而在组学分析物质中最常用的质谱技术,也有了QQQ,QTrap质谱仪,已经从基础研究应用到临床当中。各类组学技术已经在各领域得到了广泛应用。

据不完全统计,基迪奥9月发表的客户文章共25篇,有16s/ITS,宏基因组,miRNA、基因家族等方向,包括白蚁的生殖研究,百合转录因子在抗病毒中作用的研究,化疗药物应用影响的医学研究等等。本次客户文章分享,我们选择回归本源,挑选最广为人知的四大类组学的研究,给大家提供相关的解决科学问题的方法和思路。

1【植物基因组】
基因组精细图谱揭示澳洲棉抗病及腺体形成新机制

    这篇Top期刊的文章,基迪奥有5位同事作为共同作者参与完成了从测序、分析到文章发表的工作。此研究对具有抗病和腺体延缓形成等优良性状的澳洲棉(Gossypium australe)的基因组进行了从头组装,并进行了基因的功能分析和转录组的差异分析,对栽培作物的遗传改良和了解棉属植物进化历史有重要意义。


发表期刊:PlantBiotechnology Journal (IF=6.84)
合作单位:河南大学

研究目的:开发二倍体野生澳洲棉高质量基因组图谱,对抗病及腺体延缓形成等优良性状基因进行挖掘分析,揭示存在机制。

研究材料:取连续自交15代的纯合子澳洲棉新鲜叶片,用于DNA提取。以及其它8种种子无腺体和有腺体性状的澳大利亚野生二倍体棉用于研究。

研究结果:作者结合PacbioSMRT,Illumina short read,BioNano(DLS)和Hi-C,对澳洲棉进行基因组测序和组装。最终组装结果:contig N50为1.83Mb,scaffold N50 为143.60Mb,序列总长1.75 Gb,650个scaffolds覆盖了13条单倍染色体(图1)。

使用Nr, Swiss-prot, KOG和 KEGG 数据库进行基因注释,发现澳洲棉73.5%是由各种重复序列组成的,澳洲棉与G. arboreum的亲缘关系更加密切,在大约6.6百万年前分化为两个不同的种。通过多组学、Ks分析和基因功能验证发现了响应独脚金内酯(GR24),水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的黄萎病抗性相关基因GauCCD7和GauCBP1及腺体发育相关新基因GauGRAS1。

综上所述,研究为四倍体驯化棉花的一个显著不同的二倍体野生亲缘提供了高质量的参考基因组组装,以帮助棉花提高抗病性,开发具有新的无腺种子和无腺植物性状组合的品种。

图1 澳洲棉基因组的鉴定。(a)每个染色体的基因密度;(b)每个染色体中的转座因子(TE)密度;(c)每个染色体中的非编码RNA(ncRNA)密度;(d)每个染色体中的GC含量。

2【水产转录组】
拟穴青蟹无参全长转录组研究

二代测序技术由于读长较短,得到的测序片段需要拼接,可能会产生拼接错误和较多的嵌合体,不能得到完整的转录本。第三代测序Pacbio利用单分子实时测序技术(SMRT),无需拼接即可直接获取更完整、高质量的全长转录本,有利于mRNA结构的研究,如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。对于其他甲壳类动物或是没有参考基因组做比对的物种,如果不想大费周章获得全长基因去研究基因的功能,这篇文章里对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)三代无参全长转录组研究的常规思路,是可以用来借鉴的。


发表期刊:ScientificReports (IF=4.011)
合作单位:集美大学

研究目的:对拟穴青蟹进行三代全长测序。

研究样本:健康性成熟的雄性和雌性拟穴青蟹各4只,采集12种不同组织(鳃、肝胰脏、肌肉、脑神经节、眼肌、胸神经节、肠、心脏、睾丸、卵巢、精巢和血细胞)混合后测序。

研究结果:文章先提取样本中RNA进行建库,对得到的全长序列进行去冗余聚类,并用非全长序列对其进行校正,得到全长转录本,对序列结果进行评价,共获得了79,005个高质量unique转录本。然后用Nr、SwissProt、COG/KOG、GO、KEGG数据库进行蛋白和基因功能注释。之后进行了一系列基因的结构分析,包括对没有注释到的转录本鉴定lncRNA,以及用转录本鉴定SSR。结果发现大多数SSRs为二核苷酸重复序列(58.53%)(图2A)。

在二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列中,AC/GT、AAT/ATT和AAAT/ATT分别是最主要的模式。随后又在可变剪切的分析中发现,转录组存在7种不同的剪切类型,保留内含子(RI)是可变剪切的主要类型,占到了50%以上(图2B)。还对基因的isoform进行了分析,结果表明一些基因的isoform甚至超过10种。

图2 (A) SSR分布图。(B)为拟青蟹转录组中可变剪切的统计。

3【真菌蛋白组】
糖基转移酶在稻瘟病菌中的作用

稻瘟病菌可引起稻瘟病,是世界范围内栽培水稻最严重的病害之一。在对稻瘟病菌的许多致病性相关基因的鉴定和分析中发现,蛋白质糖基化在宿主感染中起着重要的作用。糖基化是在糖基转移酶(GTs)催化下,对真核生物中的分泌蛋白和膜蛋白进行翻译后的一种重要修饰。这篇文章通过构建突变体,蛋白质谱检测,结合转录组测序分析,加上一些分子实验,证明了稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)内的MoGT2对于感染过程中病菌相关的形态发生和发病机制至关重要。


发表期刊:mSphere (IF=4.447)
合作单位:华南农业大学

研究目的:研究稻瘟病菌中2型糖基转移酶(MoGt2)对病菌形态和致病性的作用。

研究材料:稻瘟病菌Guy11菌株为野生型对照,敲除MoGT2基因构建突变型菌株。在培养基中培养2天获取菌丝,提取糖蛋白,进行蛋白质谱检测。对分生孢子状态下的野生型和突变型菌株进行RNA测序,每组三个生物学重复。

研究结果:文章对MoGT2基因进行了鉴定,通过系统发育分析发现GT2蛋白在丝状真菌中具有良好的保守性(图3),推测其在真菌发育和致病性中可能具有保守功能。在和突变体培养比较发现,MoGt2对病菌生长,孢子形成,致病性和附着胞结构形成,应激等均有影响,MoGt2缺失会导致糖蛋白的改变。于是通过LC-MS/MS检测,找到了几种候选糖蛋白为MoGt2的潜在底物。

另一方面,转录组测序分析结果发现野生型和突变型菌株间共有3808个差异表达基因,1786个在生物学重复中相同。在突变体中,与分生孢子相关的基因COS2显著降低。KEGG分析发现细胞自噬通路发生富集,负责渗透反应的MAPK通路受到不同程度的调节,与渗透胁迫或细胞壁胁迫下突变体的敏感性升高一致。推测MoGt2可能通过调节这些重要的代谢和环境反应过程来发挥其在水稻分生孢子中的作用。

此外还通过调节宿主感染时的细胞壁完整性(CWI)通路和氧化反应,影响病菌的致病性。

研究最终验证了MoGt2在水稻营养菌丝的生长,分生孢子,致病性,和CWI上的作用。

图3 Gt2进化树分析。用MEGA7.0构建了真菌Gt2同源物种的邻接进化树。


4【植物代谢组】
酚类物质对微藻虾青素和脂质合成的影响

代谢组学被认为比所有其他组学技术更能反映生物体的生理特性,因为代谢物是经过复杂的转录、翻译和调控过程而产生的最终产物。本文通过代谢组学,研究丁基羟基苯甲醚(BHA)处理后,雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)分泌的虾青素和脂质合成情况。文章思路简单明朗,通过测定叶绿素、碳水化合物、蛋白质等物质含量,加上代谢组的结果,和对通路相关基因的qPCR验证,较全面地讨论了在缺氮和强光条件下BHA对微藻生理特性、细胞代谢产物和代谢网络的影响。


发表期刊:BioresourceTechnology (IF= 6.669)
合作单位:昆明理工大学


研究目的:采用代谢组学方法,比较了高光和缺氮条件下,雨生红球藻对BHA诱导包括生理反应和代谢改变在内的适应情况。

研究材料:将雨生红球藻在25±1℃光生物反应器中,用30μmol m2 s1的冷-白荧光灯照射14天。用含2mg/L BHA的缺氧的BBM培养基培养,不添加BHA培养的微藻为对照组。光强为50μmolm2 s1,取第1、5、9、13天的50mg雨生红球藻超声破碎后测定代谢组。

研究结果:研究发现缺氮和强光条件下添加BHA对微藻生长没有影响,但会影响虾青素和脂类的积累。在BHA处理后,虾青素含量提高了2.17倍,脂质含量提高了1.22倍。结合胁迫条件,绘制出添加BHA后的第5天和第13天代谢物谱的PCA图(图4A)。

之后又通过热图分析发现葡萄糖是虾青素和脂质合成的重要前体,可能在整个代谢过程中保持代谢平衡,与BHA对虾青素和脂质生物合成的增强无关。KEGG富集分析显示BHA上调了细胞基础代谢能力,激活了信号通路途径,如糖酵解途径、TCA循环、氨基酸代谢和磷脂酰肌醇信号途径。结果还对虾青素和脂质合成相关的基因的进行了qPCR验证。

以上结果说明BHA刺激对藻类的代谢产生了影响,能提高虾青素和脂质的积累,为藻类的调节能力和代谢能力提供了新的研究基础。

图4 (A)代谢图谱PCA分析。(B)代谢图谱热图分析。每组4个生物学重复。

这四篇文章涉及到植物、水产、微生物领域,包括基因组+转录组,蛋白组+转录组,三代全长无参转录组和非靶代谢组的研究,但基迪奥能做的还不止这些。

从遗传图谱,动植物重测序,转录组的ceRNA,蛋白修饰,靶向代谢组,到表观的ATAC,m6A研究,还有时下最热门的10X单细胞技术等等,基迪奥都能提供专业的测序和个性化分析。

本文作者:基迪奥萌神

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