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[转录组] 用qPCR验证RNA-Seq挑多少个基因合适?

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发表于 2016.4.26 09:29:46 | 显示全部楼层 |阅读模式
做完RNA-Seq测序之后,往往会用QPCR来验证一下结果。

因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考,参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证,表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。

一般需要验证基因的数目:20个左右

在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常现象(活久见)。

一个事实,我们看到的很多SCI都有验证实验部分,并且文章中的结果居然都是很好!很多同学心里更加捉急,为嘛我的结果不符合预期,为嘛我的结果这么挫?!

其实呢也许作者验证了多个基因,结果选取了10个效果较好的,其他验证结果不好、与预期结果不符或者自己不能阐述清楚的部分基因则建议不在文章中呈现了。所以通常在文章中阐述了少数的几个,例如10个。

具体验证多少个基因就要看准备发表的杂志水平和要求了。一般的文章验证20个左右就足够了。在RNA-Seq实验中设计生物学重复的,如果重复样本间相关系数高,只需要验证你关心的基因就行了。下面我们列出一些文献中用QPCR验证RNA-Seq的截图,包括Mrna、miRNA、Lnc-RNA,不难看出,很多基因QPCR的结果与RNA-seq是有出入的,乃们感受下。



挑选基因的建议

下面介绍下挑选做验证的基因的一般建议:
  • 首先,验证实验不只是为了验证而验证,最好还应该有生物学意义。
    所以不需要验证所有的基因,而是只需要验证个目标或者候选基因,把从这些基因差异中得到的结论说清楚,你就已经是叫兽了。建议可以先从GO和KEGG的聚类分析结果入手,看看里面跟你感兴趣的研究方向有关的基因是否存在差异。尤其KEGG是个强大数据库,从它的图上可以得到很多信息。

    总之,RNA-Seq的研究必须结合自己的研究方向,不可能全部信息都用上的,要能结合一个生物学特点或者研究机制进行深入的研究。


  • 其次,是挑选基因的原则

  • 样本间表达差异倍数大(log2(FC));
  • 基因表达量高(至少在一个样品中的表达量RPKM/FPKM大于50);
  • 基因测序深度readcount相对较高,如有些研究人员选择readcount大于20;
  • 基因长度。


这几条标准的指标目前没有统一固定的标准,需要研究人员根据自己的研究需要进行选择。

这只是最开始筛选基因的原则,等把基因找到了之后,也许这个基因设计不出来合适的引物,所以可以找到基因后还需要看看能不能按照实时定量引物设计原则设计出好的引物。

最后声明一点,用QPCR验证RNA-Seq结果,由于两种技术本身存在较大差异,所以建议仅关注两种基因表达的检测结果变化趋势是否一致,如上/下调变化趋势,而不是表达定量的值以及差异倍数(依然那句话,一定范围内的差异是不可避免的)!

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活跃会员论坛元老


发表于 2016.7.26 11:49:13 | 显示全部楼层
红叶丶李 发表于 2016.7.26 09:53
楼主您好,我想问一下,基因长度对挑选基因有什么影响吗?因为我最近发现有些差异表达的基因编码的蛋白大小 ...

如果是转录组denovo的数据,那些非常短的转录本,往往是组装不完整的转录本。这样的短转录本的RNA-seq定量结果可能不是很准。

所以,建议挑选1k以上的Unigene进行后续的验证。
新的一天加油!
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帝王蝶

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发表于 2016.4.26 09:42:39 | 显示全部楼层
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中华鲟

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发表于 2016.4.26 14:03:49 | 显示全部楼层
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帝王蝶

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发表于 2016.4.26 18:07:07 | 显示全部楼层
好文,赞!
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帝王蝶

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发表于 2016.4.26 18:59:54 | 显示全部楼层
实用,
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钵水母

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发表于 2016.4.26 21:09:00 | 显示全部楼层
如果我已经拿到了自己关心的pathway里面的基因,是不是就可以不用看差异基因的GO-PATH注释了?直接找到我关心的基因表达情况就好?
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帝王蝶

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发表于 2016.4.26 21:25:06 | 显示全部楼层
顶起来,正在做这个
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中华鲟

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发表于 2016.4.27 08:48:39 | 显示全部楼层
谢谢小瑶,解释了困惑已久的疑问!
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钵水母

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发表于 2016.4.27 08:57:13 | 显示全部楼层
拿走,拿走。。。马上要做。。。祝自己顺利
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 楼主| 发表于 2016.4.27 09:08:14 | 显示全部楼层
北轩小陌 发表于 2016.4.27 08:57
拿走,拿走。。。马上要做。。。祝自己顺利

祝你顺利
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钵水母

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发表于 2016.4.27 09:26:23 | 显示全部楼层

3Q,3Q,借你吉言,必须完美啊,不然哭了就
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功夫熊猫

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灌水之王


发表于 2016.4.27 09:37:15 | 显示全部楼层
支持支持。我也想做这个。
呵呵
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发表于 2016.4.27 14:13:43 | 显示全部楼层
你好
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中华鲟

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发表于 2016.4.27 15:39:45 | 显示全部楼层
很棒,赞一个
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突出贡献优秀版主论坛元老


发表于 2016.4.27 17:09:30 | 显示全部楼层
好好好好好
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中华鲟

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发表于 2016.4.28 22:17:28 | 显示全部楼层
涨姿势了呀
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钵水母

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发表于 2016.4.30 19:56:24 | 显示全部楼层
如果做qPCR验证的话也是要三次重复的吧?
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钵水母

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发表于 2016.5.1 08:38:05 | 显示全部楼层
真是受用。
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钵水母

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发表于 2016.5.1 22:30:11 | 显示全部楼层
有个问题,热图将原本不该归为一类的材料归为一类了,怎么解决/
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迅猛龙

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发表于 2016.5.2 01:28:54 | 显示全部楼层
这个不是验证的问题,如果我感兴趣的pathway有40-5-个基因,我需不需要全部拿来做q-PCR?还是直接用转录组的数据来做热图或者别的?

点评

验证一部分即可。验证是为了表明数据可靠,所以只是抽样调查,不需要验证太多。  发表于 2016.7.26 11:46
太难了
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