求教含糖量高的组织的RNA提取

自在飞

我做的材料是多糖材料（果皮），而且多酚含量很高，用TRIZOL法一直没有结果，求大虾指点啊~~

自在飞

我用了专门针对多糖多酚含量高的植物的提取试剂盒，可是最后一步溶解RNA的时候还是特别不好溶，跑胶发现孔里很亮，应该是有多糖杂质，或者蛋白，或者别的，或者都有……

Flier

TRIzol法无法去除糖、酚类物质。建议试一下CTAB提取，先不管降不降解了，先看看能不能提出核酸（DNA和RNA），如果能提取出来，再考虑尽量保持RNA完整性，避免降解，慢慢来。
PS：有些公司所谓的提取多糖多酚类RNA试剂都扯淡，我曾经也被坑过，根本提不出来！

自在飞

Flier 发表于 2015-12-8 17:38
TRIzol法无法去除糖、酚类物质。建议试一下CTAB提取，先不管降不降解了，先看看能不能提出核酸（DNA和RNA） ...

我是这么处理的，试验用的玻璃仪器，研钵均在180℃处理4h以上，枪头、ep管均用0.1%DEPC水处理过夜，高压灭菌烘干后使用。
本人对整个操作过程还是很熟练的，之前提取过叶片和根皮的总RNA都成功了。
请问有具体的实验方法吗？谢谢！

基迪奥—何德飞

      建议你试下硫氰酸胍提取方法（仅供参考），硫氰酸胍能溶解细胞并使蛋白变性，当用于抽提缓冲液时，可产生无RNase的环境。组织抽提后，以中等转速离心匀浆液，以除去不溶性多糖。用苯酚/氯仿将上清液抽提出，RNA位水相，DNA和蛋白质位于苯酚相和两相交界面。用醋酸钾将位于水相的多糖选择性的沉淀出来。然后用氯化锂选择性将RNA从残余的污染物中纯化出来。

基迪奥—何德飞

自在飞 发表于 2015-12-8 18:02
我是这么处理的，试验用的玻璃仪器，研钵均在180℃处理4h以上，枪头、ep管均用0.1%DEPC水处理过夜，高压 ...

（一）材料与设备
1.        0.75mol/L 柠檬酸钠，pH 7.0 (含柠檬酸)。用0.1% DEPC处理并高压灭菌。
2.        10% (w/v) N-月桂肌氨酸（N-lauroyl sarcosine）。
3.        硫氰酸胍缓冲液：用293 ml无菌去离子水，17.6ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠，26.4ml 10% N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于65℃溶解250g 硫氰酸胍（不用称重）。
4.        抽提缓冲液：每5ml 硫氰酸胍缓冲液加36µl 巯基乙醇。若被提取组织含多聚苯酚，抽提缓冲液中可加入聚乙烯聚吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrolidone）(20% w/w)。
5.        氯仿/异戊醇49：1（v/v）。
6.        2 mol/L 醋酸钠，加乙酸至pH 4.0 。
7.        酸性苯酚：500g 晶体苯酚溶于500ml去离子水中，50ml每份于－20℃保存，4℃可保存一个月。
8.        异丙醇。
9.        70%和100%乙醇。
10.        2 mol/L 醋酸钾，加冰醋酸至pH 4.8。
11.        1O mol/L LiC1。
12.        TNE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 室温, 150mmol/L NaC1, 1 mmol/L EDTA。
13.        TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 1mmol/L EDTA。
14.        研钵和研杵。
15.        液氮。
16.        离心机。
17.        玻璃Pasteur 吸量管，200℃干烤至少3小时。

基迪奥—何德飞

自在飞 发表于 2015-12-8 18:02
我是这么处理的，试验用的玻璃仪器，研钵均在180℃处理4h以上，枪头、ep管均用0.1%DEPC水处理过夜，高压 ...

（二）操作方法
1.        在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末，勿让组织解冻。
2.        在研磨过程中，加入3.5ml抽提缓冲液，充分研磨。将匀浆转移到一个10ml聚丙烯管。用1ml抽提缓冲液冲洗研杵和研钵，然后移至聚丙烯管中。
3.        23000g，4℃，离心20 分钟。
4.        用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入10ml 聚丙烯管。
5.        加0.4ml 2mol/L 醋酸钠，混合混匀。加4ml苯酚，混匀。加0.8ml氯仿/异戊醇，混匀。
6.        聚丙烯管置于冰上 15 分钟。
7.        离心，方法如步骤3。
8.        用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入30ml 聚丙烯管，加入同样容积的         2mol/L 醋酸钾，混合混匀。
9.        聚丙烯管置于冰上至少30 分钟。
10.        44000g，4℃离心20 分钟。
11.        将上清液移入15ml 聚丙烯管，加0.6-1 倍体积的100%的冰异丙醇，混匀，-20℃ 放置45 分钟。
12.        以2700g，于4℃离心20 分钟。
13.        轻轻倒出上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀，如步骤12离心3 分钟，尽可能将乙醇倒净。
14.        加入400µl DEPC 处理的水溶解沉淀，移至1.5ml管中。
15.        加100µl 10mol/L LiC1, 4℃ 放置至少2 h。
16.        12000g，4℃离心20 分钟 。
17.        用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
18.        加入200µl TNE 重悬沉淀，再加500µl 100% 乙醇，-20℃ 放置至少15 分钟。
19.        如步骤16离心5分钟 。
20.        用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
21.        加入200-400µl TE 重悬沉淀。
22.        将每个样本稀释30-50倍，在 230nm，260nm，280nm测量吸光度。

基迪奥—何德飞

最后是注意事项
1.        开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀（若用的是叶子），不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层。
2.        当吸取上清液时，应十分小心，勿搅乱胶状沉淀，因为该层非常软。上清液的体积大约4 ml，若因沉淀多而使体积明显不足时，用抽提缓冲液补足。
3.        加入乙酸钾后，延长孵育时间（达30 分钟）会提高 RNA 的质量，尤其出现蛋白污染时。多糖形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量高，延长孵育时间（至60 分钟）也有助于沉淀更多的多糖。
4.        加入异丙醇后，不应看到沉淀，任何可见的沉淀表明大量多糖的存在。孵育时间大于60 分钟，就会形成多糖沉淀。
5.        RNA 沉淀应为白色，若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况，将沉淀再悬浮于200µl TE，加1倍体积的2mol/L 醋酸钾，冰上孵育30 分钟。12,000g ，4℃离心 20 分钟。将上清液移至一新1.5ml 管中，用2.5 倍体积的100% 乙醇沉淀RNA，-20℃，15 分钟. 继续方法中的步骤16。
6.        判断RNA分离的成功与否，测量在230，260，280nm处的紫外吸收可以评估RNA的产量和质量。若A260／230值小于2，则表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260:A280比值小于1.7，表明蛋白污染。在琼脂糖凝胶上出现的28S和18S rRNA，可用以评估RNA的完整性。
7.        该方法提取的RNA适于poly(A)＋的分离，Northern 分析，cDNA 分析，RT-PCR扩增。

仅供参考，希望对你有所帮助，:lol

自在飞

基迪奥—何德飞 发表于 2015-12-9 10:46
最后是注意事项
1.        开始的离心去除了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗 ...

好详细，非常感谢，回头我去试试。

大熊

基迪奥—何德飞 发表于 2015-12-9 10:46
（二）操作方法
1.        在液氮中将0.4g 组织研磨为细粉末，勿让组织解冻。
2.        在研磨过程中， ...

好专业呀！！

基迪奥—何德飞

大熊 发表于 2015.12.10 10:56
好专业呀！！

正好之前给一个客户整理过。

496071151

这个专业

cxy

来领奥币的额，抱歉啦

hld8124

不错，很详细的方法

开挂

建议试试全是金的植物RNA提取试剂盒

王启超

我们用的是百泰克的，感觉还不错！你也可以试试......

自在飞

王启超 发表于 2016.4.27 14:45
我们用的是百泰克的，感觉还不错！你也可以试试......

哦，你提的是什么组织？

王启超

自在飞 发表于 2016.5.3 22:05
哦，你提的是什么组织？

我提的是叶片，不过也是多糖多酚，可能比你的少点

chai1986

学习了，谢各位大虾

zhouqian2617

学习了！