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[转录组] 10X genomics ScRNA-seq定制分析

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    发表于 2019.7.2 10:03:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
    定制分析类型所谓定制分析,就是某些分析必须基于项目的生物学背景做出调整。对于这样的分析,生信公司必须与客户开展配合,无法用一套标准流程蒙头完成所有工作。
    对于10X Genomics ScRNA-seq,常见的定制化分析请见下表。从表中可以看出,对基础分析内容基于生物学背景进行解析,是后续定制分析的基础,必须由生信公司与客户通力配合才能做好。
    表1 四种定制分析以及依赖的生物学背景信息

    目标亚群进一步细分

    过去对细胞的定义,由于只是基于形态学或少量分析标记,所以对细胞的鉴定精度只能到大类级别,例如T细胞、内皮细胞等。但对于10X 单细胞转录组,由于纳入了上千个分子标记,完全可以将每大类细胞进一步定义到子亚群级别。
    因此,目前大部分10X单细胞文章,在初步完成细胞分类鉴定后,一般还会提取比较关注的(2~3种)细胞类型,进一步细分子亚群,期望能有新的发现。这个分析比较简单,却可能发现亮点,是一种高性价比的定制分析。
    例如,在2018年《Nature Medince》研究肺肿瘤微环境的文章,就是在分出7种基质细胞的基础上,对这7种细胞进一步进行了一一精细分类,一共得到了52种子亚群(图1)。


    图1 肺癌基质细胞的分群 (Doi: 10.1038/s41591-018-0096-5)



    以其中的内皮细胞为例,进一步可以分出6个亚群。通过分子标记,进一步鉴定结果如下:
    (1)淋巴内皮细胞, (cluster 6,标记基因:PDPN and PROX1,在癌和癌旁都存在)
    (2)血管淋巴细胞 (cluster5,标记基因:FLT1+,在癌和癌旁都存在)
    (3)主要来源肿瘤的亚群(clusters 3和4;,标记基因:IGFBP3+和SPRY1+)
    (4)主要来源癌旁的亚群 (clusters 1 and 5,标记基因:MT2A+ h和EDNRB+)
    亚群2因为没有找到任何标记基因,且数据质量相对较差,因此被剔除没有用于后续分析。从这里也可以看出,对于10X转录组数据,由于细胞量比较大,可能会不断有新的类型细胞被发现,那么细胞定义上允许带有一定主观性(例如,这里第3和第4类内皮细胞)。如果有少量亚群的确无法定义,在文章中承认也是可以被接受的。


    图2 肺癌样本内皮细胞的进一步分类


    特定亚群(子亚群)的差异表达分析

    在基础分析中,只是筛选每个类型细胞的标记基因(上调表达)。10X单细胞转录组本质还是转录组数据,而且样本数更高(注意:这里说的样本是每个细胞),分组信息更加复杂。
    常见的转录组实验设计一般是两个变量因素,主要是个体维度(例如,建库组vs 患病组,品种A vs 品种B)和时间维度(例如,不同发育阶段/病程发展不同阶段)。而10X转录组又加入了细胞亚群的维度,因此可以进行更丰富、精细的差异分析。
    一些属于一个大类但不同子亚群的细胞,就可能值得单独两两比较。例如在2017年Nature Communication 一篇研究小鼠乳腺上皮细胞动态变化的文章中,作者发现亚群6和7虽然都被鉴定为乳腺管腔祖细胞,但亚群6主要来源未生育过的小鼠,亚群7主要来源生育过的小鼠。
    通过两个子亚群单独差异的差异分析,发现亚群7上调表达的基因主要富集在免疫反应和哺乳两个通路里。这说明虽然都是乳腺管腔祖细胞,经历过怀孕的个体的祖细胞在细胞中会留下记忆,从而在基因表达上有所不同(这一般与表观调控有关,可以考虑结合10X ATAC-seq来研究)。


    图3 两个乳腺管腔祖细胞亚群间的差异分析(DOI: 10.1038/s41467-017-02001-5)


    另外可以继续开展类似常规转录组的差异分析策略,但可以在细胞亚群的尺度开展分析,可能会有新的发现。以同样的病人vs正常人间的差异分析为例,两种数据分析结果的差别如下表。

    表2 两种技术差异分析效果的比较



    细胞亚群水平的差异分析,可能对于疾病机制的研究,靶向治疗的开发,有极大潜力。因为某些病变可能只发生于组织中的部分细胞类型,而不是整个组织。过去常规的转录组可能会遗漏这样的关键信息,而现在10X转录组可以帮助找回这些信息。

    Tips:对10X genomics ScRNA-seq分析感兴趣的老师和同学可留言咨询,基迪奥会为您量身定制专业的个性化实验分析方案。

    拓展阅读
    10X单细胞RNA-seq基础分析步骤与常见图形解析(下)
    10X单细胞RNA-seq基础分析步骤与常见图形解析(上)
    为什么要做单细胞测序



    本文作者:周老师


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