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植物翻译组研究的经典案例

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    发表于 2019.3.22 14:03:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
    相信关注我们公众号的老师都已经了解翻译组测序(translatome)这个“新”组学技术了。其实,翻译组的研究一早就在2009年就已经报道了,到现在已经有10年了。
    这几年来翻译组的文章大量呈现,已经在酵母、果蝇、小鼠、人等物种中开展了广泛的研究,而我们之前的微信文章也着重于介绍翻译组在研究肿瘤发生发展中的作用。

    那么,在植物领域也能做翻译组吗?答案当然是肯定的,并且目前已有越来越多的植物翻译组文章了,在拟南芥、玉米、大麦、小麦、大豆、燕麦、南瓜、豌豆、烟草等物种中都有相关的报道。

    其中,拟南芥和玉米的基因翻译模式是研究得最多的。翻译组在研究植物的生长发育、细胞生理、逆境胁迫等方面具有重要的作用。

    今天我们就来解读一篇利用翻译组研究玉米抗旱应答机制的文章,该文章虽然发表时间较早(2015年),里面的思路却是翻译组研究的经典套路,想要进行翻译组研究的老师可以好好学习一下。


    发表杂志:the plant journal
    影响因子:5.93

    研究背景与目的

    植物可以通过各种机制在转录和翻译水平上对环境变化做出反应。目前在转录水平上的植物胁迫应答已有大量的研究,而在翻译水平上的研究却非常少。因此,文章的研究目的是揭示植物在干旱胁迫下的基因翻译变化。

    实验设计

    生长14天的玉米幼苗,分别进行干旱处理(DS)以及正常对照处理(WW),然后进行RNA-seq和ribo-seq测序,设置两个生物学重复。


    Fig1.实验设计 研究思路



    研究结果

    1ribo-seq数据特征分析

    就跟做RNA-seq会对测序数据进行统计分析一样,ribo-seq测序后也需要对数据进行分析。而且因为ribo-seq是对与核糖体结合的正在进行翻译的RNA片段进行测序,因此数据有其一定的特点,根据这些特点我们就可以判断ribo-seq的实验成功与否。因此,结果分析的第一步就是要对ribo-seq的数据特征进行分析,分析结果如下:

    分析RFP的长度,发现主要分布在30bp(Fig2 a)左右, 与之前的报道基本一致。
    在翻译过程中,核糖体是一次向前滑动三个核苷酸的。本文数据发现在起始密码子和终止密码子附近有很强的三碱基周期性(Fig2 b)。
    在起始密码子和终止密码子附近,RPF reads的数量显著增加,这说明翻译起始和终止可能是玉米基因翻译的限速步骤(Fig2 c)。
    RPFs在编码基因上的分布:绝大部分的RPFs(97.5%)位于基因的CDS区,只有2.1%和0.4%的RPFs位于5’UTR和3’UTR上。而干旱处理后,位于5’UTR和3’UTR上的RPFs比例增加,分别增至3.6%和0.5%(Fig2 d)。表明UTR特别是5'UTR可能潜在翻译,可能在胁迫应答中具有调控作用。


    Fig2ribo-seq数据特征分析

    2干旱胁迫改变基因在翻译水平和转录水平的表达

    干旱处理后,在转录水平鉴定出1646个表达上调基因和2870个表达下调基因,在翻译水平鉴定出1779个表达上调基因和3832个表达下调基因(Fig3 a)。下调基因的数目在两个水平上都比上调基因的数目多,表明干旱胁迫导致了基因在转录和翻译水平上的整体表达下降。
    利用polysomeprofiling证明干旱胁迫导致翻译抑制,结果显示DS苗的多聚核糖体(PP)比例下降,单核糖体(MP)比例上升,说明了DS苗的基因翻译总体上受到了抑制(Fig3 b)。
    将差异表达的转录基因与翻译基因作维恩图,发现不到一半的差异基因在转录组和翻译组中所共享(Fig3 c),这表明干旱胁迫可以独立地引起转录和翻译反应。而转录组数据和Ribo-seq数据两者的整体相关性为0.69。
    将基因的转录丰度变化与翻译丰度变化进行关联分析,绘制九象限图,发现59%的基因属于C类和G类(转录水平与翻译水平变化一致)(Fig4)。对B,H,D,F象限(即转录水平与翻译水平变化不一致)的基因进行GO功能富集分析,结果显示四个象限中的基因分别富集到不同的GO功能。


    Fig3基因在转录水平和翻译水平的表达变化比较


    Fig4基因的转录丰度变化与翻译丰度变化散点图

    3干旱胁迫导致大量基因的翻译效率发生显著变化

    对基因进行翻译效率TE的计算, 发现基因的TE变化幅度达4000倍以上,表明大量基因经历了高度动态的翻译调控(Fig5 a)。例如与光合作用有关的基因的转录丰度和TE都比所有其他表达基因的转录丰度和TE高(Fig 5a)。

    表明这些光合作用相关基因在玉米幼苗快速生长中的转录和翻译活性很高。干旱处理后共有538个基因TE降低(2.8倍以上)、393个基因TE增加(2.7倍以上)(Fig 5 b),表明调节基因翻译效率可能是植物逆境反应中的重要途径。


    Fig5基因翻译效率分析

    4基因的翻译效率受其序列特征的影响

    据报道,基因的序列特征有助于增加与多核糖体相关的mRNAs的比例,并进一步影响蛋白质的丰度。作者研究了基因CDS、3'UTR和5'UTR区的三个序列特征:序列长度、归一化最小自由能(NMFE)和GC含量,并评估了它们对相应基因翻译效率的潜在影响。

    对于CDS: 翻译效率较高(log2(TE)>1)的基因具有较短的长度、较高的GC含量和较低的NMFE(Fig 6 a)。对于3'UTR: 翻译效率较高的基因和翻译效率较低的基因之间的差异相对较小。在3'UTR中,只有最高翻译效率组(Log2(TE)>1)的基因具有较短的长度、较高的GC含量和较低的NMFE。

    对于5'UTR:翻译效率较高的基因(log2(TE)>1)具有较短的长度、较低的GC含量和较高的NMFE。 接下来,作者检查具有一致和不一致表达模式的基因的序列特征是否不同。基于Kolmogorov-Smirnov检验(KS检验),累积曲线表明表达模式一致(Fig 3c 中重叠部分的基因)的基因在CDS中GC含量更高、NMFE更低(Fig 6b、c).。此外,5’UTR中GC含量较低的基因往往受到一致的调控。


    Fig6序列特征对翻译效率的影响

    5uORFs的鉴定

    Fig2 d显示干旱处理后,5’UTR上的RPFs比例增加,暗示着5'UTR上的某些元件可能参与胁迫应答。而uORF(位于5'UTR区的小ORF)已报道能够抑制下游主开放阅读框(mORFs)的翻译。在玉米中之前只有两个含有uORF的基因被报导。而通过Ribo-seq可以从全基因组上去鉴定这种含有uORF的基因。
    基于5'UTR区的AUG起始密码子进行uORF预测,得到7927个含有uORF的基因(平均每个基因含有2个uORF, 长度平均为36bp)。2558个基因上含有3063个平均长度为105bp的核糖体结合的uORF。 6uORF翻译抑制了mORF的翻译
    为了研究uORFs的翻译对下游mORFs翻译的影响,将基因分为三类:具有不翻译uORFs的基因、具有一个翻译uORFs的基因、以及具有多个翻译uORFs的基因。研究这三类基因的TE,结果显示,uORFs翻译显著降低了相应基因的TE(Fig7 g),并且翻译的uORFs数量越多,相应基因的TE降低幅度越大。
    另外,比较DS苗和WW苗uORFs的翻译效率。结果显示DS苗的uORFs的翻译效率更高,表明玉米在干旱胁迫下uORF翻译增加,进而调控下游mORFs的翻译表达。(Fig7 h)。


    Fig7.uORF翻译对下游mORF翻译的影响

    总结

    本文利用RNA-seq和ribo-seq对玉米进行了干旱胁迫的基因表达翻译研究,思路清晰,先是对ribo-seq测序数据进行特征分析,然后进行翻译定量、翻译调控、新可翻译分子这三大ribo-seq分析内容的分析,从整体上揭示了玉米在干旱胁迫下的基因翻译变化。
    将翻译组的这三个主要分析内容堆砌起来,就可以发一篇不错的文章了。而如果文章能够关注某个发生翻译变化的特定基因,并且利用功能实验进行翻译调控机制的研究,则可以大大提升文章的创新性,可以发表更高分的杂志。

    Tips:对翻译组测序感兴趣的老师和同学可留言咨询,基迪奥会为您量身定制专业的个性化实验分析方案。

    本文作者:基迪奥小师妹


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