好忧桑！qPCR验证与转录组测序结果不一致

小瑶

看到这个题目就好忧桑dèi不dèi。经常有很多人问这个问题，比如某个同学就挑了一堆（20个）基因用qPCR做验证，然后只有1个基因的表达量上下调趋势与qPCR验证结果一致，也是醉了……怎么办？莫慌，作为一个有节操的小编，我们是会告诉大家怎么解决的。

我们先来分析一下两者不一致的原因有哪些。

1.原因可能有：

1）样品对比关系搞反了（A vs B）；

这个需要对照测序公司的原始数据，查看结果，比如某个基因的差异倍数的表头写着A vs B ，那么就是B除以A。

2）没有用同一批样品来检验；

这点很重要，不用问什么，大家照做就好了……

3）样品有污染、核糖体污染——转录组的基因表达量计算有误；

一般来说，在计算转录组测序基因表达量的时候，都要求去掉核糖体的。

4）做QPCR验证的基因表达量偏低，差异不显著；

这点也很重要，也不要问为什么，因为用表达量很低的基因做验证， 并没什么卵用~

5）两种方法本身存在差异，出现不一致情况也正常（40%左右）。

我们认为在一定情况下，出现不一致也属正常；然后这个具体要看审稿人什么意见，再做解释……哈哈

2.相应的解决办法有

1）检查样品对比关系有无搞反；

2）用同一批样品来做转录组和QPCR；

3）排除样品污染；

比如核糖体污染、真菌样品的排除细菌污染等；

4）尽量挑选差异显著的基因，表达量不能太低；

5）排除了以上所有可能后，结果还不一致的话，先检查QPCR结果是否正确，比如只是挑了一个基因的话，如果你确定QPCR没有问题的，那就以他为准。如果你挑了20个基因，结果都不一致的话，那要看下测序数据的分析是否有无问题。然后同时检查老师预期是否有误。

dabaouc

出现不一致的就不要了

Isoforms

取决于分析方法的假阳性高低

开挂

验证了15个，其中一个差异不显著，照样放在稿子里了····
希望审稿人手下留情

小瑶

开挂 发表于 2016.4.14 10:18
验证了15个，其中一个差异不显著，照样放在稿子里了····
希望审稿人手下留情
...

God bless you~

开挂

小瑶 发表于 2016.4.14 10:38
God bless you~

小瑶保佑我吧

小瑶

开挂 发表于 2016.4.14 12:24
小瑶保佑我吧

小瑶要保佑的人有点多啊

开挂

小瑶 发表于 2016.4.14 16:03
小瑶要保佑的人有点多啊

自古以来就是能者多劳啊！

hx-z-r0924

一般转录组的文章做多少验证合适？

gefei511

楼主分析不错，学习了

luna

如何验证差异显著不显著？是用三次荧光定量重复的数据吗？

ly5253ly

好吧，照做就好了，最好是别出问题

jianjian1105

谢磊

不错，学习了

luvena

luna 发表于 2016.4.19 08:47
如何验证差异显著不显著？是用三次荧光定量重复的数据吗？

我自己做的时候，是重复能多做则多做，一次做6个重复，从出来的结果里面选最好的去做差异分析。简单粗暴又高效。

北轩小陌

看了很担心啊。。。我的也正在做。。。也怕不一样啊。。。

小瑶

北轩小陌 发表于 2016.4.22 13:32
看了很担心啊。。。我的也正在做。。。也怕不一样啊。。。 ...

这位同学，心态要积极点~

gefei511

北轩小陌

小瑶 发表于 2016.4.22 13:59
这位同学，心态要积极点~

我非常想积极啊。。。。

telomerase

可以用IGV看看有些是不是mismapping