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看到这个题目就好忧桑dèi不dèi。经常有很多人问这个问题,比如某个同学就挑了一堆(20个)基因用qPCR做验证,然后只有1个基因的表达量上下调趋势与qPCR验证结果一致,也是醉了……怎么办?莫慌,作为一个有节操的小编,我们是会告诉大家怎么解决的。
我们先来分析一下两者不一致的原因有哪些。
1.原因可能有:
1)样品对比关系搞反了(A vs B); 这个需要对照测序公司的原始数据,查看结果,比如某个基因的差异倍数的表头写着A vs B ,那么就是B除以A。
2)没有用同一批样品来检验; 这点很重要,不用问什么,大家照做就好了……
3)样品有污染、核糖体污染——转录组的基因表达量计算有误; 一般来说,在计算转录组测序基因表达量的时候,都要求去掉核糖体的。
4)做QPCR验证的基因表达量偏低,差异不显著; 这点也很重要,也不要问为什么,因为用表达量很低的基因做验证, 并没什么卵用~
5)两种方法本身存在差异,出现不一致情况也正常(40%左右)。 我们认为在一定情况下,出现不一致也属正常;然后这个具体要看审稿人什么意见,再做解释……哈哈
2.相应的解决办法有
1)检查样品对比关系有无搞反;
2)用同一批样品来做转录组和QPCR;
3)排除样品污染; 比如核糖体污染、真菌样品的排除细菌污染等;
4)尽量挑选差异显著的基因,表达量不能太低;
5)排除了以上所有可能后,结果还不一致的话,先检查QPCR结果是否正确,比如只是挑了一个基因的话,如果你确定QPCR没有问题的,那就以他为准。如果你挑了20个基因,结果都不一致的话,那要看下测序数据的分析是否有无问题。然后同时检查老师预期是否有误。
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