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[其他] 评估测序文库复杂度 Library Complexity

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宣传达人优秀版主


发表于 2017.9.13 15:09:02 | 显示全部楼层 |阅读模式
本文转载自PLoB社区,原文地址:https://www.plob.org/article/10866.html

在制备测序文库时,经常会增加PCR的步骤来扩增DNA片段。如何评估PCR的效果和影响,本文主要分享ENCODE中针对ChIP-Seq和ATAC-Seq标准来说明。

ENCODE中主要通过三个参数来反应Library Complexity:PCB1,PBC2和NRF。以下分别介绍各自的定义:

PCR Bottlenecking Coefficient 1 (PBC1)
PBC1=M1/M_DISTINCT where
M1: number of genomic locations where exactly one read maps uniquely
M_DISTINCT: number of distinct genomic locations to which some read maps uniquely

PCR Bottlenecking Coefficient 2 (PBC2)
PBC2= M1/M2 where
M1: number of genomic locations where only one read maps uniquely
M2: number of genomic locations where two reads map uniquely

Non-Redundant Fraction (NRF) - Number of distinct uniquely mapping reads (i.e. after removing duplicates) / Total number of reads.

如何计算这三个数值呢,在我们拿到比对的结果后(SAM或者BAM文件)
对于single end测序,以align.bam为例:

[AppleScript] 纯文本查看 复制代码
bedtools bamtobed -i align.bam | \
awk \'BEGIN{OFS="\t"}{print $1,$2,$3,$6}\' | \
grep -v \'chrM\' | sort | uniq -c | \
awk \'BEGIN{mt=0;m0=0;m1=0;m2=0} ($1==1){m1=m1 1} ($1==2){m2=m2 1} {m0=m0 1} {mt=mt $1} END{m1_m2=-1.0; if(m2>0) m1_m2=m1/m2; printf "%d\t%d\t%d\t%d\t%f\t%f\t%f\n",mt,m0,m1,m2,m0/mt,m1/m0,m1_m2}\' > pbc_qc.txt


对于pair-end测序,以align.bam为例:

[AppleScript] 纯文本查看 复制代码
bedtools bamtobed -bedpe -i align.bam | \
awk \'BEGIN{OFS="\t"}{print $1,$2,$4,$6,$9,$10}\' | \
grep -v \'chrM\' | sort | uniq -c | \
awk \'BEGIN{mt=0;m0=0;m1=0;m2=0} ($1==1){m1=m1 1} ($1==2){m2=m2 1} {m0=m0 1} {mt=mt $1} END{m1_m2=-1.0; if(m2>0) m1_m2=m1/m2; printf "%d\t%d\t%d\t%d\t%f\t%f\t%f\n",mt,m0,m1,m2,m0/mt,m1/m0,m1_m2}\' > pbc_qc.txt


最后文件中包含7列,分别为:
1)TotalReadPairs
2)DistinctReadPairs
3)OneReadPair
4)TwoReadPairs
5)NRF=Distinct/Total
6)PBC1=OnePair/Distinct
7)PBC2=OnePair/TwoPair

对于ChIP-seq结果解读:





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突出贡献优秀版主


发表于 2017.9.14 09:24:40 | 显示全部楼层
收藏学习
。。。。。。
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中华鲟

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发表于 2017.12.5 09:14:54 | 显示全部楼层
先谢谢分享
加油,顺顺利利~!
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中华鲟

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发表于 2019.12.16 08:21:14 | 显示全部楼层
感谢
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中华鲟

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灌水之王


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钵水母

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发表于 2020.4.19 21:17:47 | 显示全部楼层
谢谢
太开心了
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功夫熊猫

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加油,加油!
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