马上注册,结交更多好友,享用更多功能,让你轻松玩转社区。
您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册
x
1、在2ml无Rnase的离心管中加入810μL提取液和30μLβ-巯基乙醇。 2、取样(100mg左右),液氮充分研磨,将研磨好的样品加入离心管中。 3、充分涡旋至无块状物质,冰浴15min。4℃,12000rpm离心15min。 4、取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。 5、取上清,加入1/3体积的KAc(5M),充分混匀。4℃,12000rpm离心15min。 6、取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。 7、取上清,加入1/3体积的LiCl(8M),-40℃沉淀2-3h。 8、4℃,12000rpm离心15min。 9、弃上清,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。 10、倒掉乙醇,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。 11、倒掉乙醇,短暂离心,吸去残留乙醇,室温晾干。 12、加入20-40μL无Rnase ddH2O溶解。 13、加入4μL Dnase,5μL 10×Dnase Buffer,2.5μL Rnasin,用无Rnase ddH2O补齐至50μL,37℃水浴30min。 14、反应后,加入450μL无Rnase ddH2O稀释。 15、加入等体积水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。 16、取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。 17、取上清,加入1/10体积的NaAc(3mol/L,PH=5.2)和2.5体积无水乙醇。 18、-40℃沉淀2-3h(-20℃沉淀4h)。 19、4℃,12000rpm离心15min。 20、弃上清,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。 21、倒掉乙醇,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。 22、倒掉乙醇,短暂离心,吸去残留乙醇,室温晾干。 23、加入20-40μL无Rnase ddH2O溶解。
注意: 1、氯仿:异戊醇去除蛋白时吸去上清一定要特别注意,不然会引入蛋白污染。 2、最后一步酒精一定要挥发干净,防止酒精污染。 3、经常更换手套。
提取液: | | | | | | | | | | | | | | | | | | DEPC水定容至100ml,68℃水浴溶解,高温高压灭菌。 |
KAc: =29.5ml冰醋酸,固体KOH调PH,DEPC水定容至100ml,PH=4.8 量29.5ml冰醋酸,加入20mlDEPC水至瓶中,然后加入固体KOH片30片(加入过程要缓慢,防止沸腾,该反应为放热反应),调PH至4.8。
LiCl: 50ml DEPC水中加入16.96g LiCl,高温高压灭菌。 DEPC水: DEPC终浓度为0.1%,高温高压灭菌。
烘箱: 200℃,处理9个小时,仅限金属和玻璃器皿,切勿放入塑料器皿。 塑料器皿用DEPC水浸泡过夜后,锡箔纸包好,高温高压灭菌30min。 NaAc: 称取40.8gNaAc・3H2O置于200ml烧杯中,加入40mlDEPC水溶解,加入冰醋酸调PH至5.2,用DEPC水定容至100ml,室温保存。
|