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[RNA提取] 多糖多酚植物RNA提取方法

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钵水母

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发表于 2016.1.21 11:28:57 | 显示全部楼层 |阅读模式

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1、在2ml无Rnase的离心管中加入810μL提取液和30μLβ-巯基乙醇。
2、取样(100mg左右),液氮充分研磨,将研磨好的样品加入离心管中。
3、充分涡旋至无块状物质,冰浴15min。4℃,12000rpm离心15min。
4、取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。
5、取上清,加入1/3体积的KAc(5M),充分混匀。4℃,12000rpm离心15min。
6、取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。
7、取上清,加入1/3体积的LiCl(8M),-40℃沉淀2-3h。
8、4℃,12000rpm离心15min。
9、弃上清,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。
10、倒掉乙醇,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。
11、倒掉乙醇,短暂离心,吸去残留乙醇,室温晾干。
12、加入20-40μL无Rnase ddH2O溶解。
13、加入4μL Dnase,5μL 10×Dnase Buffer,2.5μL Rnasin,用无Rnase ddH2O补齐至50μL,37℃水浴30min。
14、反应后,加入450μL无Rnase ddH2O稀释。
15、加入等体积水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。
16、取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),充分涡旋。4℃,12000rpm离心15min。
17、取上清,加入1/10体积的NaAc(3mol/L,PH=5.2)和2.5体积无水乙醇。
18、-40℃沉淀2-3h(-20℃沉淀4h)。
19、4℃,12000rpm离心15min。
20、弃上清,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。
21、倒掉乙醇,加入1ml75%乙醇洗涤,离心10min。
22、倒掉乙醇,短暂离心,吸去残留乙醇,室温晾干。
23、加入20-40μL无Rnase ddH2O溶解。

注意:
1、氯仿:异戊醇去除蛋白时吸去上清一定要特别注意,不然会引入蛋白污染。
2、最后一步酒精一定要挥发干净,防止酒精污染。
3、经常更换手套。

提取液:
组分
质量/g
终浓度
LiCl
0.593
140mM
Tris
1.21
100mM
PVP
2
2%
SDS
5
5%
EDTA(PH=8.0)
0.3724
10mM
DEPC水定容至100ml,68℃水浴溶解,高温高压灭菌。

KAc:
=29.5ml冰醋酸,固体KOH调PH,DEPC水定容至100ml,PH=4.8
量29.5ml冰醋酸,加入20mlDEPC水至瓶中,然后加入固体KOH片30片(加入过程要缓慢,防止沸腾,该反应为放热反应),调PH至4.8。

LiCl:
50ml DEPC水中加入16.96g LiCl,高温高压灭菌。
DEPC水:
DEPC终浓度为0.1%,高温高压灭菌。

烘箱:
200℃,处理9个小时,仅限金属和玻璃器皿,切勿放入塑料器皿。
塑料器皿用DEPC水浸泡过夜后,锡箔纸包好,高温高压灭菌30min。
NaAc
称取40.8gNaAc・3H2O置于200ml烧杯中,加入40mlDEPC水溶解,加入冰醋酸调PH至5.2,用DEPC水定容至100ml,室温保存。

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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.1.21 11:29:43 | 显示全部楼层
专治各种多糖多酚!
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推广达人宣传达人论坛元老


发表于 2016.1.22 11:27:51 | 显示全部楼层
给楼主点个赞
哈啊哈哈
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帝王蝶

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发表于 2016.4.9 18:00:52 | 显示全部楼层
保存了,感谢!
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钵水母

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发表于 2016.4.11 21:23:44 | 显示全部楼层
楼主辛苦了! 我前段时间找到一个提多糖多酚植物的不错的试剂盒,名字是华越洋  效果很好。我是用来建酵母双杂交文库的  
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草履虫

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发表于 2016.4.19 15:15:51 | 显示全部楼层
大公无私,实用
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功夫熊猫

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灌水之王


发表于 2016.5.9 11:06:08 来自手机 | 显示全部楼层
保存一下,用的上。谢楼主
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草履虫

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发表于 2016.5.18 22:14:06 | 显示全部楼层
楼主强大
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钵水母

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发表于 2016.6.5 22:11:48 | 显示全部楼层
我们提取过小麦种子的,都是用试剂盒,效果还挺好的
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帝王蝶

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发表于 2016.9.16 19:36:41 | 显示全部楼层
能把去除原理给降解下么?比如多糖是用提取液中何种成分在哪一步如何去除的
加油啊
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中华鲟

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发表于 2016.11.4 16:43:04 | 显示全部楼层
试试吧
好久好久 没来了
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帝王蝶

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周一啦
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中华鲟

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发表于 2019.11.17 10:29:32 | 显示全部楼层
感谢楼主分享。适合提取苹果~
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中华鲟

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发表于 2019.11.19 08:35:29 | 显示全部楼层
强势帮顶一波,好人会有好报
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中华鲟

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发表于 2019.11.27 08:33:43 | 显示全部楼层
好人一生平安。
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钵水母

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发表于 2019.12.18 16:45:01 | 显示全部楼层
好帖子,必须鼓励
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钵水母

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发表于 2019.12.18 16:45:38 | 显示全部楼层
好帖,必须鼓励
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灌水之王


发表于 2020.4.7 14:21:14 | 显示全部楼层
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽
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钵水母

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中华鲟

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灌水之王


发表于 2020.5.24 07:58:04 | 显示全部楼层
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