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无参物种如何进行单细胞转录组研究?

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发表于 2021.10.21 09:36:48 | 显示全部楼层 |阅读模式
其实关于无参物种如何进行单细胞转录组研究的问题,相信一直以来都在关注基迪奥微信公众号的小伙伴们应该有所了解,因为在我们前期的推文中,专门就非模式物种(包括无参物种)的单细胞研究进行过探讨(文章链接:《单细胞的非模式物种时代》),甚至我们还为此邀请了业界优秀学者共同举办过网络研讨会,还没有看过小伙伴、以及萌新们可以戳链接看回放噢~

视频链接:
https://www.omicshare.com/class/home/index/series?id=81


那么针对非模式物种,尤其是无参物种我们如何进行单细胞转录组研究呢?首先要克服的难题就是参考基因组,面对这个问题,大家最容易想到的一个方案就是组装一个基因组,但这种方式难度较大、成本较高,尤其是时间成本。因此早在去年年底我们就推荐大家可以使用三代全长转录组技术构建参考转录本,然后直接将单细胞转录组测序数据与参考转录本比对,完成表达定量,实现无参物种的单细胞研究。这种方式有效节省了时间和金钱成本,最重要的是其可行性也已经得到了验证

此话怎讲?是的,已经有应用这一策略的单细胞文章发表啦!

文章于上个月发表在Frontiers in Immunology期刊,首次借助了三代全长转录组技术完成了无参物种斜带石斑鱼脾脏组织单细胞研究。而基迪奥生物有幸参与其中,为客户提供了三代全长转录组和单细胞转录组测序及数据分析服务


合作单位:集美大学
发表期刊:Frontiers in Immunology
影响因子:7.564

研究背景

鱼类被认为是阐明脊椎动物免疫进化和调节机制的最高模式。然而,对鱼类不同免疫细胞群的认识仍然有限,需要进一步发展技术,以促进鱼类免疫细胞群及其功能的鉴定。单细胞转录组技术(scRNA-seq)为有效深入鉴定和表征细胞亚群提供了一种新的方法。目前的scRNA-seq数据分析方法通常依赖于与参考基因组的比较,因此不适合没有任何参考基因组的样本,但目前鱼类研究中非常多的物种都没有参考基因组。本文作者提出了一种替代方法,即以全长转录本作为参考的scRNA-seq数据分析。

实验设计

作者首先将体重为45.0±1.5g的健康斜带石斑鱼随机分组。实验组每条鱼腹腔注射103 CFU/g的假单胞菌,对照组注射无菌PBS。取假单胞菌感染48小时斜带石斑鱼脾脏组织进行scRNA-seq。取假单胞菌感染0、24、48、72和96h斜带石斑鱼脾脏和肠道组织进行三代全长转录组测序。

图1 实验设计流程图

研究结果


1. 三代全长转录组构建参考转录本


为了验证以全长转录组作为参考进行scRNA-seq数据分析的可能性,并对尚未发表基因组的斜带石斑鱼样本进行评估,作者首先对斜带石斑鱼进行了三代全长转录组测序。一共获得21,132,749个子reads,平均大小为1,507 bp,鉴定出32,715个高质量isoform,最终将相似度为99%的序列组合,得到每个样本的全长转录组,总长度为72,588,100 bp。

紧接着,作者借助KEGG、KOG、Nr和Swissprot对转录本进行功能注释,最终有27,405个转录本被成功注释。此外作者还对注释失败的转录本进行了lncRNA和可变剪接(AS)事件预测,共预测了3,000个lncRNA和2,468个AS事件。

图2 参考转录本构建流程图

2. 三代全长转录组策略序列比对准确性

参考转录本构建完成后,作者正式开始借助参考转录本分析单细胞转录组数据,为了验证结果的准确性,作者平行使用了斜带石斑鱼的同源物种鞍带石斑鱼的参考基因组进行了对照分析。结果显示,两种策略下的测序饱和度、有效细胞数、基因中位数都非常接近,这证明了全长转录组提供的基因信息足以支持后续的分析,并且三代全长转录组策略下,序列比对的准确性相对更高,但数据的利用率要稍低一些(表1)。

表1 不同策略下数据利用率对比

3. 三代全长转录组策略细胞聚类准确性

细胞聚类分群的准确性直接影响着细胞亚群鉴定和后续数据的深入挖掘,因此,作者进一步探究了三代全长转录本策略下,细胞聚类分群情况。结果显示,基于全长转录组细胞被分为8个亚群(图3A),而基于同源物种参考基因组只获得了6个亚群(图3B),表明基于全长转录组的细胞聚类准确率较高,但从细胞频率以及最终的鉴定结果来看差异不是特别明显。最终两种策略下,细胞鉴定结果一致,均包含B细胞、T细胞、NCC细胞、红细胞、巨噬细胞共五种细胞类型(图3C/D)。

图3 A)三代全长转录组策略细胞聚类分群图;B)同源比对策略胞聚类分群图;C)三代全长转录组策略细胞鉴定图谱;D)同源比对策略细胞鉴定图谱

4. 三代全长转录组策略再分群分析

细胞的异质性探究是单细胞转录组测序的主要应用方向之一,主要通过再分群分析以及亚群上调基因分析挖掘亚群内细胞异质性。本文作者基于全长转录组成功绘制斜带石斑鱼脾脏组织细胞图谱之后,进一步挖掘了巨噬细胞和B细胞亚群内异质性。结果显示,巨噬细胞被细分为2个子亚群,经鉴定依次为Ⅰ/Ⅱ型巨噬细胞(M1/M2),并且M1占主导(图4A/B);B细胞被细分为4个子亚群,经鉴定依次为早幼B细胞、前B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞(图4C)。最后,作者对B细胞各子亚群进行了拟时分析,结果与预期相符,再次验证了三代全长转录组策略聚类分群的准确性(图4D)。


图4 A)M1/M2型巨噬细胞marker基因表达分布气泡图;B)M1/M1型巨噬细胞数量堆叠图;C)B细胞各子亚群marker基因表达分布气泡图;D)B细胞亚群分化轨迹图


小结

这篇文章首次探讨并验证了三代全长转录组构建参考转录本进行无参物种单细胞转录组数据分析的可行性,为无参物种进行单细胞研究提供了新的思路。文章通过与同源物种参考基因组对照分析,验证了全长转录组序列比对和亚群聚类的准确性,证明了全长转录组提供的基因信息足以支持后续的分析。所以,如果你还在为你研究的物种没有参考基因组而发愁,不妨试一试三代全长转录组策略,加速你的单细胞研究进程~

▼参考文献▼

[1] Full-Length Transcriptome: A Reliable Alternative for Single-Cell RNA-Seq Analysis in the Spleen of Teleost Without Reference Genome. Front Immunol. 2021 Sep 27;12:737332.


本文作者:基迪奥-September

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