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没有深入的分子实验,这个单细胞转录组项目也发了8分文章

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中华鲟

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发表于 2020.9.29 09:43:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2020.9.29 09:41 编辑

单细胞转录组经典的应用思路,首先是基于单个细胞的转录水平对细胞进行聚类分群,根据各细胞群特征表达基因进行亚群注释,绘制全细胞图谱,从整体水平,观察某种功能异常对所有细胞群组成分布的影响,在此基础上进一步利用差异分析锁定到关键细胞群,然后对关键细胞群进行精细分析,包括细分子亚群、差异分析、富集分析、以及针对不同类型细胞群进行的个性化分析。

最终我们可以将表型背后的生物学机制锁定到一条关键通路或关键基因的变化上,再加以分子生物学实验验证。基于这种总—分—分的经典研究架构,我们可以讲述一个完整清晰的生物学故事,是高分文章发表的基础。

话不多说,今天我就和大家分享一篇由基迪奥合作单位中国药科大学发表在Theranositics上研究免疫细胞在Vsir-/-小鼠牛皮癣中功能的文章,带大家直观感受一下单细胞转录组经典应用思路是如何发表高分文章的。


期刊:Theranostics
影响因子:8.579
合作客户单位:中国药科大学

研究背景:

牛皮癣是最常见的自身免疫性皮肤病,全世界有近2%-3%的人患有此病。Vsir(V-set immunoregulatory receptor)是T细胞和骨髓细胞表达的抑制性B7家族免疫检查点分子,它的缺失促进了炎症反应,导致了牛皮癣的恶化,但Vsir在牛皮癣疾病中具体作用机制尚不清楚,本文旨在利用单细胞转录组技术从免疫细胞图谱层面揭示Vsir在小鼠牛皮癣疾病进展中潜在的作用机制。

研究材料:

使用小分子免疫调节剂IMQ诱导牛皮癣疾病小鼠模型,选取6-7周龄Vsir-/-突变型和野生型C57BL/6的雌性小鼠,IMQ连续诱导5天,取牛皮癣背部病灶皮肤组织,制备单细胞悬液,用于单细胞转录组测序。

研究思路:


结果解读:

全局细胞图谱构建

对于细分领域的首篇文章,我们在实验设计时,可以聚焦于大而全的细胞图谱构建,利用单细胞转录组技术,抢先获得细胞全貌特征,为该领域研究提供新的更全面的信息,有助于该领域后续的研究发展,同时也有利于高分文章的快速发表。

这篇文章作者在前期课题调研中发现,Vsir-/-作为新的免疫检查点,它的缺失导致了牛皮癣疾病的恶化,但其作用机制尚不清楚,免疫细胞在这一过程中的功能亦不清晰,因此,作者利用单细胞转录组技术首次获得了Vsir-/-牛皮癣小鼠病灶皮肤组织全局细胞图谱。t-SNE结果显示病灶皮肤组织中有巨噬细胞(macrophages)、脂肪细胞(adipocytes)、树突状细胞(DCs)、成纤维细胞、中性粒细胞(neutrophils)、T细胞等12种类型细胞。

图1 细胞亚群t-SNE映射图

各细胞亚群的精细分析

生物学研究本质上都是从整体到局部、从一般到个性的过程。因此,在我们得到样本全细胞图谱之后,首先需要关注的就是实验组与对照组之间细胞组成成分的差异,分析在某类疾病或表型的成因过程中哪种类型细胞发生紊乱,这对了解疾病或表型机制和靶向研究,有重要意义。

本文作者利用单细胞转录组技术获得全局细胞图谱后,分析了两组样本中细胞的组成成分,根据细胞群数量占比差异及组间细胞组成成分差异,筛选了三个重要的细胞亚群进行了深入讨论。分析结果显示,巨噬细胞占比最大,在野生型(WT+IMQ)小鼠组织样本中占比77.7%,在Vsir-/-突变型(Vsir-/-+IMQ)小鼠组织样本中占比61.29%,而树突状细胞和成纤维细胞两样本间具有显著的数量差异。

图2各细胞亚群数量总占比

①巨噬细胞亚群分析

对细胞亚群的精细分析,一般从两个方面入手。首先基于单细胞转录组数据,利用生物信息学分析细胞亚群在样本间的差异表达基因及其生物学功能,然后结合分子生物学实验验证生信分析结果,这是一种典型的组学+实验研究的模式。

本文作者基于差异表达基因分析对巨噬细胞再分群,得到9个子亚群,拟时分析结果显示这些子亚群拥有共同的分化轨迹。组间差异表达基因分析,研究结果显示,与伤口修复相关基因Hspb1(heat shock protein beta-1),以及与炎症反应相关基因Cebpb(CCAAT/enhancer binding protein)在Vsir-/-突变组巨噬细胞中明显上调。

结果提示,Vsir可能通过调控Hspb1和Cebpb的表达影响巨噬细胞在免疫系统中的功能。GO功能富集分析结果表明在Vsir-/-突变小鼠牛皮癣疾病进展中,巨噬细胞主要发挥促进蛋白折叠和抑制细胞凋亡的作用。

同时,作者利用免疫组化实验研究发现巨噬细胞特征蛋白CD68和LY6G在小鼠牛皮癣皮肤组织样本中的表达丰度明显高于T细胞特征蛋白CD3,这也进一步说明是巨噬细胞而非T细胞在小鼠牛皮癣疾病进展中发挥重要作用了。

图3 A)巨噬细胞亚群t-SNE映射图;B)免疫组化检测CD68、LY6G 、CD3在WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣组织中的表达情况;
C)WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤巨噬细胞中差异表达基因热图;D)WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤巨噬细胞中差异表达基因GO功能富集圈图

②树突状细胞亚群分析

关键细胞群的选择可以基于组间细胞数量最大的细胞群,也可以基于组间细胞数量差异显著的细胞群,二者都具有重要研究价值。

样本间细胞数量统计结果显示,树突状细胞亚群在Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤组织中占比较WT小鼠明显增多,提示树突状细胞亚群Vsir-/-牛皮癣小鼠疾病进展中关键细胞群。为了揭示这一细胞数量差异,作者对树突状细胞亚群进一步细分到4个子亚群,发现cluster0是主要的子亚群,cluster 1/2在Vsir-/-小鼠中明显增多,拟时分析结果显示Vsir-/-牛皮癣小鼠中的树突状细胞子亚群cluster2位于轨迹的晚期,而WT牛皮癣小鼠中位于轨迹的早期。

作者利用组间差异表达基因分析进一步揭示树突状细胞在Vsir-/-突变小鼠牛皮癣疾病进展中的功能,结果显示,Hspb1、Cebpb在Vsir-/-突变组树突细胞中明显上调,与巨噬细胞中趋势一致。差异基因GO富集分析表明在Vsir-/-突变小鼠牛皮癣疾病进展中,树突状细胞主要参与细胞因子的产生和细胞活化过程。

图4 A)树突状细胞亚群t-SNE映射图;B)各子亚群在WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤组织样本中的分布情况;
C)WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤组织树突状细胞中差异表达基因热图;D)WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤组织树突状细胞中差异表达基因GO功能富集图表

③成纤维细胞亚群分析

在文章解读过程中我们发现,炎症相关的两个重要基因Hspb1、Cebpb在Vsir-/-小鼠牛皮癣组织样本的巨噬细胞和树突状细胞中都明显高表达,提示这两个基因可能为Vsir的特征调控基因,是文中另外一条潜在研究思路,因此作者对这个两个基因高表达的细胞亚群也进行了分析。

作者利用差异表达基因分析,将成纤维细胞亚群进一步细分得到3个子亚群,其中巨噬细胞相关的基因Fcer1g、Tyrobp特征性富集到cluster1子亚群中。同时,作者利用组间差异表达基因分析进一步揭示了成纤维细胞在Vsir-/-突变小鼠牛皮癣疾病进展中的功能,差异分析结果同样发现与炎症相关基因Hspb1、Cebpb在Vsir-/-突变组成纤维细胞中也明显上调,GO富集分析表明在Vsir-/-突变小鼠牛皮癣疾病进展中,成纤维细胞主要发挥免疫应答和损伤修复作用。

图5 A)成纤维细胞亚群t-SNE映射图;B)各子亚群在WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤组织样本中的分布情况;
C)WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤成纤维细胞中差异表达基因热图;D)WT和Vsir-/-小鼠牛皮癣皮肤成纤维细胞中差异表达基因GO功能富集图表

总结

本文作者利用单细胞转录组技术构建了全局细胞图谱,并利用细胞群数量占比差异分析以及组间细胞群组成差异分析,筛选到与Vsir-/-突变小鼠牛皮癣疾病进展相关的关键细胞群:巨噬细胞亚群、树突状细胞亚群、成纤维细胞亚群,然后利用差异分析、拟时分析、GO富集分析以及分子实验验证对各细胞亚群展开精细分析,揭示了免疫细胞在Vsir-/-小鼠牛皮癣疾病进展中的作用,为研究Vsir-/-在牛皮癣疾病中的功能提供了一个新的研究思路,并为后续深入研究牛皮癣疾病奠定了一个基础。

这篇文章是单细胞转录组经典研究思路在文章中的再现,文章以单细胞转录组技术为核心,大量篇幅都是基于组学水平对各个细胞亚群的解析,没有进行深入的分子实验,但仍然发表了一篇8分以上的高分文章,这对于未利用单细胞转录组研究过的疾病或表型,是一个值得借鉴的经典实用的文章套路。

值得说明的是这篇文章从测序、数据分析挖掘到SCI结果图绘制均有我们基迪奥生物协助客户完成,其中差异基因GO富集圈图是我们公司特有的分析结果图,该圈图集GO term基因总数、差异上调基因数、差异下调基因数、富集因子信息于一体,图形不仅信息丰富而且精美直观。

基迪奥生物具有丰富的单细胞转录组项目经验,完善的生信分析流程,专业的技术支持,旨在为您提供优质的测序分析服务。有测序需求的老师可以与我们公司当地销售联系!

参考文献:
[1]Qie C, Jiang J, Liu W, Hu X, Chen W, Xie X, Liu J. Single-cell RNA-Seq reveals the transcriptional landscape and heterogeneity of skin macrophages in Vsir-/- murine psoriasis. Theranostics. 2020 Aug 21;10(23):10483-10497.

本文作者:基迪奥-September
               


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发表于 2020.9.29 18:10:52 | 显示全部楼层
差异基因GO富集圈图是我们公司特有的分析结果图
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虽然没钱做,但是先眼个熟
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哒哒哒哒哒哒多多多多多多多多多多多多多
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