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[动植物重测序] 大牛是这样玩转基因精细定位与克隆

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发表于 2016.8.10 17:57:42 | 显示全部楼层 |阅读模式
之前我们分享过遗传图谱各种作图群体介绍(戳这里查看~),今天我们再分享一篇相关的文章解读。这篇文章在QTL定位的不同阶段,逐步构建了不同类型的初级作图群体和次级作图群体,从而逐步提高QTL定位的精度,并最终锁定目标基因。
文章思路清晰,论证严谨,涉及的群体世代广泛,而且对如何构建作图群体,如何进行不同精度的QTL定位等经典问题给出近乎完美的答案。下面我们来一起欣赏大牛们是如何把科学研究做到极致吧!



1.摘要

土壤盐度限制着植物生长,因此植物耐盐基因的鉴定对育种有着重要意义。本研究通过QTL初定位、精细定位和高分辨定位的三步定位方法,逐步筛选出拟南芥中未被报道的耐盐基因RAS1。后续通过分子实验证明RAS1与植物的耐盐性相关,并且这种耐盐功能依靠ABA通路实现。这篇文章是经典的图位克隆文章,想了解QTL定位具体步骤的同学,本研究是很好的成功范例。

2.背景资料

为了方便对后面实验思路和实验结果解读的理解,我们对文章所涉及到的一些关键内容做一下简单的介绍:

拟南芥品种(品系):

Ler:盐和ABA敏感品种(品种1)
Sha:全称Shakdara,盐和ABA不敏感品种(品种2)
Col-0:Col生态型野生品种(品种3)
Bay-0:Bay生态型野生品种(品种4)
NIL(RAS1):Ler背景的近等基因系,但1号染色体上具有Sha的RAS1背景。

性状:
1)绿苗(Green Seedlings,GS):分辨拟南芥是否有耐盐能力的其中一个性状。在高盐(120 mM NaCl)环境下,植株绿苗比例越多,表示耐盐性越好。
2)根长(Root Length,RL):分辨拟南芥是否有耐盐能力的另外一个性状。在高盐(120 mM NaCl)环境下,植株绿根系越长,表示耐盐性越好。

作图群体分类:
F2:子二代,初级作图群体兼临时作图群体,一般用于QTL初定位。
BC2F2:回交两次的F2群体,初级作图群体兼临时作图群体,一般用于QTL初定位。
RIL:重组自交系,初级作图群体兼永久性作图群体,一般用于QTL初定位(定位精度略优于F2)。
NIL:近等基因系,次级作图群体兼永久性作图群体,遗传背景单一,一般用于QTL精细定位和验证。
注:更多关于作图群体类型的介绍请点击这里查看。

3.研究路线





图1 文章的技术路线图

4.结果解读

1.QTL初定位


利用耐盐品种Sha和盐敏感品种Ler为亲本,构建F2和重组自交系(RIL)。利用F2群体构建连锁图谱,同时分别通过114株RIL的GS和RL性状筛选,鉴定出RIL的1号染色体上存在耐盐相关的QTL基因座RAS1(图2)。后续利用Col-0和Ler衍生的重组自交系验证此QTL位点的存在。


图2 利用GS和RL两种性初定位耐盐QTL

利用Sha和Ler建立的F2群体作图后,通过GS鉴定出1个耐盐相关QTL(绿色);通过RL鉴定出4个耐盐相关QTL(红色),其中1号染色体上有一个两种性状共有QTL为候选区域,命名为RAS1。

关键点评:利用F2群体这类型的初级群体作图,只能定位到较大范围的QTL。例如本研究,F2构建连锁图谱后,最终定位到1号染色体的QTL区域约为约44cM(图3),跨越nga59到M1-10共15个分子标记(全基因组共66个标记)。


图3 QTL初定位耐盐区域

2.QTL精细定位

在Sha和Ler构建的RIL中,挑选CS24560(图4)与Ler构建F2:3群体(备注:F2:3群体指的是使用F2群体进行QTL定位,但F2群体表型的评估来源于它们的子代F3群体,即后裔测定),从而对RAS1 QTL进行精细定位。定位后发现RAS1基因座在1号染色体的F14J9-13 和 T10O24-59两个分子标记之间(图5),这一结果与初定位结果相符。


图4 CS24560的基因型包含Sha(黑色)和Ler(白色)遗传背景


图5 QTL精细定位RAS1在标记F14J9-13 和 T10O24-59之间

关键点评:在此精细定位过程中,虽然也是用到F2群体作图,但这个F2群体实际是由初定位所建立的RIL系衍生而来的,因此,在此定位过程中所用到的图谱实际是一个基于RIL系的遗传图谱。利用上述图谱定位的QTL,被有效缩小到12个分子标记(F14J9-13到T10O24-59),共计约9.5cM的区域以内(图5)。

3.高分辨率定位

利用CS24560与Ler体系构建4454个回交群体BC2F2(同时利用BC2F3和BC2F4做后裔表型鉴定),通过F14J9-13和T10O24-59两个分子标记筛选后,建立遗传图谱。利用此图谱对QTL进行高分辨率定位,逐步缩小RAS1基因座到分子标记F21M12和F21M12-130之间(图6)。


图6 QTL高分辨定位RAS1在标记F14J9-13 和 T10O24-59之间

后续通过BC2F3的后裔鉴定,把候选区域定位在13.7kb以内(图7)。在这段13.7kb的区域中,预测发现有4个ORF,通过测序验证了At1g09950为RAS1的候选基因。


图7 利用BC2F3进行后裔鉴定实验

关键点评:利用回交建立的BC2F2群体,能最大限度地减少Sha遗传背景的干扰。同时在作图的时候扩大采样数目(4454个个体),有效地增加重组次数,也能够减少噪音。最终把QTL的定位缩小在物理距离为13.7kb的5个标记以内的区域。

4.基因验证及功能实验

基因序列差异:
利用QTL定位耐盐候选基因RAS1后,比较Ler、Sha和Col-0三个品系的RAS1序列发现,Sha的RAS1基因存在一个提前终止密码子,造成其蛋白存在一段21个氨基酸的缺失(图8)。因此推断RAS1氨基酸序列的缺失是引起Sha有更高耐盐性的关键。


图8 Ler、Sha和Col-0三个品系的RAS1氨基酸序列比较

近等基因验证:
为了验证RAS1与耐盐能力相关,构建带有Sha品种RAS1基因背景的近等基因系NIL(RAS1),发现它比Ler品系具有更高的盐和ABA耐受能力(图8)。从而证明Sha的RAS1基因型(序列缺失型RAS1)会导致植株有更高耐盐能力。


图9 Ler和NIL(RAS1)在高盐和高ABA条件下的生长比较

反向验证实验:
利用转基因技术,把一个能完整地表达Ler品系RAS1的片段导入到Ler、NIL(RAS1)和Sha品系当中,分别新构建OX2、OX5和OX9三个转基因品系。与各自的正常品系相比,三个新品系都显示出更高的盐和ABA敏感性(图9)。这反向证明Ler的RAS1基因型(序列完整型RAS1)会导致植株有更高的盐敏感性。


图10 OX2、OX5和OX9三个转基因品系在高盐和高ABA的生长情况

T-DNA、RNAi等其他验证实验:
在Col-0的RAS1中插入T-DNA,抑制RAS1的完整表达后发现,具有不完整RAS1的变异植株比正常植株更加耐盐和抗ABA(图10)。利用Ler、 Sha、NIL(RAS1)三个品系进行RNAi实验,或利用Ler、Sha、NIL(RAS1)、Col-0等多个品系进行的过表达实验,也证明了序列完整的RAS1(Ler型RAS1)能够负调控植株抗盐能力。


图11 野生型Col-0(左)与T-DNA插入品系(右)在高盐和ABA下表现出不同的生长状况

关键点评:QTL定位RAS1基因后,利用不同分子实验(近等基因系验证,反向验证,T-DNA插入,RNAi等),最终证明RAS1就是最终与耐盐性相关的基因,并且序列完整的RAS1(Ler型RAS1)在植株抗盐过程中起负调控作用。

5.文章小结

1.文章通过不同作图群体,构建不同精度的图谱后,结合QTL定位方法,从初定位、精细定位到高分辨定位,一步一步缩小抗盐QTL的范围,并最终发现RAS1的候选基因。
2.发现了RAS1基因后,利用近等基因系验证,反向验证,T-DNA插入,RNAi等多个实验手段,最终鉴定RAS1与植株的抗盐作用有关。其中,Ler品系中序列完整的RAS1在抗盐过程中起负调控作用,而Sha品系中序列缺失的RAS1造成植株耐盐性提高。
3.其实文章也有提及RAS1可能并不在RNA水平而是在蛋白水平起作用。理由一:Northern blot实验显示高盐和ABA可以诱导RAS1表达,但它的表达模式在Ler、NIL(RAS1)和Sha三个品系中并没有差异;理由二:序列比对发现,Sha的RAS1序列存在一段提前终止密码子,这会引起Sha的RAS1蛋白表达不完整。由于文章对此观点没做过多分析,因此也不在此进行详细描述。

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迅猛龙

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,学习。
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先膜拜一下!
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帝王蝶

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好多群体,看得我好伤心。。。
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钵水母

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学习学习,
好久没来了
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钵水母

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强哥
哈哈哈哈
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迅猛龙

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厉害,学习了
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草履虫

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草履虫

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