第5期在线交流“转录组测序数据深度挖掘 ”回顾

小瑶

第5期在线交流“转录组测序数据深度挖掘”回顾

2015年9月29日，基迪奥在信息交流群（QQ群：67185986）举办了转录组测序数据深度挖掘主题交流，交流的问答整理如下：

交流PPT在此下载：

问1：做鸡的RNA-seq一般测序深度要达到多少呢？

答：RNA-seq 4G数据量足够了，不同物种的编码的基因的数量是很稳定的，一般4~5G数据量足够了。除非是多倍体。

问2：4G就够了，是指每个生物学重复都需要4G是吗？

答：每个生物学重复建议最低2.5 G。

问3：最近公司主推的项目是2.5G，那不是不能满足要求吗？

答：二倍体，对基因表达进行定量，也足够了。另外关于数据量，大家要有个概念：1个样本测7.5 G vs 3个重复，每个重复测 2.5G。 总数据量相同，到底哪个设计更准。 有很多文献报道，将相同的数据量分配到更多的生物重复，最终定量的准确性是更准的。

问4：油菜做RNA-seq做多大数据？

答：油菜4倍体，4~5G也足够，因为大部分项目有生物学重复。

问5：RNA文库构建选择的是什么载体？

答：文库构建没有载体。

问6：怎么去除rRNA？

答：反转为cDNA。

问7：请问合成第二链的时候用到rnase，如何保证不把所有rna酶解掉，只剩下一段作为第二链的引物合成第二链呢？

答：杂交去除rRNA，即使不是100%，只要量足够就可以。

问8：想要做假基因的话，RNA-seq的方法是一样的么？

答：假基因建议使用lncRNA测序。因为假基因可能没有ployA结构，属于 lncRNA范畴。

问9：我想问一下，如何选择测序深度？

答：关于这个问题，可以查看这篇文章http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA5NzQzOTgzMw==&mid=200825762&idx=1&sn=e1e219c30c666dfed09085d404a7b59c#rd

问10：请问FPKM是什么？country，strand里面的正负号表示什么？如何计算基因的差异表达倍数？

答：FPKM的定义，可以百度一下；strand里面的正负号表示DNA的正负链；计算基因的差异表达倍数用100除以50 等于2

问11：计算基因的差异表达倍数用100除以50 等于2，不是用log2foldchange或foldchange表示吗？

答：2 取log2 = 1

问12：在注释的时候有注释的就能确定方向，但是不一定有CDS序列，是因为CDS序列要求满足100nt吗？

答：这是人为设定的标准。

问13：TPM和FPKM有什么区别呢？

答：TPM比较复杂,可以理解为tag和transcript，PM意思为每百万reads或fragment。一个是reads，一个是fragment。

问14：趋势分析的适用范围？

答：经典的时序性,有时间梯度或处理梯度的样本，适合趋势分析。如果没有这样的梯度，使用其他聚类方法也是ok的。例如 k-mean。

小瑶

问15：单纯的两组数据对比的就用不了趋势分析了？

答：不能，可以考虑使用共表达，两组趋势，后期数据不好整理。

问16：共表达网络分析有样本数要求吗？

答：网络分析推荐8个样本以上。

问17：网络分析8个样品，包括生物学重复吗？

答：不包括，假如是生物学重复，建议15个样本。

问18：那两组，每组三个生物学重复，可以做网络分析吗？

答：不可以，样本不够。

问19：趋势分析中的富集，是怎么定义？以所有基因为背景数据?

答：是的。

问20：趋势分析要用什么数据呢？

答：趋势分析适用表达量数据，一般使用差异表达的基因。

问21：趋势分析是用差异表达基因的log2foldchange吗？

答：是用FPKM。

问22：趋势分析中的模块是指表达趋势一致的基因集？还是功能分类？

答：表达趋势一致，后面会对这些表达趋势一致的模块进行富集分析。

问23：每个模块多少基因比较好？

答：这不是人为设置的，通过构建网络的过程中，你只能控制大概多少模块。

问24：如果构建的模块有的基因多有的基因少，有利于后续分析吗？

答：模块有大有小，一般太小的模块（例如小于40个基因）会被丢弃。

问25：有上限基因个数吗？

答：并没有。

问26：WGCNA是用什么软件做的？

答：R 包。

问27：可以做蛋白互作吗？

答：不可以，蛋白质谱的表达量信息，不适合WGCNA分析。因为蛋白的表达定量不稳定。

问28：蛋白互作是什么做的？

答：Cytoscape。

问29：WGCNA在芯片中研究比较多吧，RNA-seq做WGCNA好像不太准？

答：那还因为样本数不够，RNA-seq本身定量比芯片准。

小瑶

问30：请问实验比对不同时期的转录组，以找差异基因。转录组测序每个样品有3个生学重复，这样不同时期比对的话，怎么比对比较科学？

答：如果是3~4个时期，建议趋势分析。如果5个以上的数据，考虑进行共表达网络分析。

问31：除了趋势分析，还有什么方法可以减少seq后的候选基因？

答：趋势分析一般不是用来减少候选基因。

问32：在使用cufflinks中cuffcompare时，输出的.tracking文件中的转录本好像比在combined.gtf中的转录本多，是为什么呢？

答：这个要看实际的结果，一般情况下仅用来展示两者的相似程度。

问33：但是通过转录本的ID来看，为什么track的文件会比combined.gtf的多呢？

答：track一般把全部的转录本进行比较，combined一般都是过滤后的。

问34：就是说应该以combined的文件为准是吧？

答：是的。

问35：他是以什么样的原则过滤掉的呢？

答：可以参考一下compare的文档。

问36：RNA-seq做平行重复，结果如何分析，一致性要达到多少，才算ok？如果取差异表达基因，是不是挑两次或三次重复中均有变化的？

答：重复的样本的处理，是组间差异分析。

问37：gap填充如果没有填完，还有碱基没有确定，拿这些N是直接在最终的序列中跳过了呢？还是用N表示了？

答：用N表示。

问38：DEseq的标准化方法是什么？

答：有几种。deseq 默认的为上四分位标准化，另外还有TMM 等等。

问39：找到的SNP怎么知道在基因的哪个位置，CDS 或者其他的?

答：做注释，一般都是自己写程序注释SNP的位置。

问40：如果对照和试验组都是取混合样去测序的，后来的验证取每个样验证，这样可以减少混合样测序所产生的没有生物学重复的质疑吗？

答：不能，审稿人会质疑的，关键基因都使用qPCR验证，可以减少质疑。这是统计学的问题，没有重复，你无法说服我，这个结果是否准则。

问41：验证基因如何选择更好？

答：验证你研究关键基因。

问42：转录组测序得到lncRNA的序列，并不是它的全长吗？那定量的时候怎么设计引物呢？能根据测序得到的序列进行设计吗？

答：应该是全长，但由于实验上，测序上各种误差导致有可能不是全长；我们一般会预测一段lncRNA，根据这段序列进行设计引物。

问43：亲本有三种类型，两两杂交得到六种F1类型，每个F1类型内选取不同的极端材料测RNA-seq，相应的亲本也测了，现在找差异基因怎么找？

答：这个问题比较开放。这个实验设计，需要了解生物学背景，具体的讨论，可以与基迪奥技术沟通。

问44：实验组与对照组的样本不是一个批次的，怎样去除批次效应？

答：实验条件要控制好，这很难去除。

ras

wangyanlq11

没有视频吗

tom1234

谢谢！但奥币就像澳元一样坚挺，我该怎么办？

小瑶

tom1234 发表于 2016.3.7 10:09
谢谢！但奥币就像澳元一样坚挺，我该怎么办？

勤签到、多回复、多发贴

北极燕鸥

RSEM计算完，会出现counts、TPM、FPKM值，我应该选择哪一个值多热图呢？为什么呢？

martin1207

都好高深的！勉强看完了···

yang80

学习了，但是有些还是不懂，继续学习！

王启超

NICE！非常棒，有助于理解相关生物信息问题！

hepeng

高，深。努力修炼吧~

Shirley

感谢分享资料

wangzhaoyi

感谢分享

chuankang17

谢谢分享

tracyqi

谢谢分享~

y461650833y

好资源啊 顶起！

limbo111

感谢分享

maligang

谢谢分享！

xhy702

太棒了