第3期在线交流“lncRNA测序数据挖掘”回顾

小圆

第3期在线交流“lncRNA测序数据挖掘”回顾

2015年8月25日，基迪奥在信息交流群（QQ群：67185986）举办了lncRNA测序相关的交流，交流的问答整理如下：

在线交流PPT在此下载：

问1：IncRNA在复合体中的作用机制是怎样的呢?

答：lncRNA的作用机制比较多样，包含作为复合物骨架，decoy，guide等作用。可以查阅相关的综述，来了解这些作用机制的实例。

问2：super -enhancer会被转录为RNA吗？

答：是的。 已经有相关报道表明，enhancer通过产生 enhancerRNA（来源增强子的lncRNA）来起到转录增强的调控作用。因此，Super enhancer 极有可能被转录为lncRNA。

问3：有没有对疑似lncRNA进行分析的数据库？

答：lncRNA的鉴定主要包括：1）同源比对；2）编码蛋白能力的预测。

前者，主要是是一些序列收录的数据库，例如noncode 数据库。如果能在这些数据库中找到同源序列，就可以对lncRNA 进行初步的判定；

如果是后者，还是需要自己使用一些软件，例如CPC ，进行分析。暂时还没有听说，哪些数据库提供蛋白编码能力预测的分析。

问4：怎么做lncRNA的功能？有些什么机制？好像筛出来lncRNA但机制并不好做

答：包括：敲除，过表达、pulldown等。 只要在 CNS 级别的期刊，一般在找到候选lncRNA后，会有详细的功能验证试验。 机制验证的试验当然不好做，要找到正确的候选lncRNA，且试验比较耗费时间。难度越大，文章回报也越高。

问5：对于lncRNA,预测的RPKM值低于多少认为其没有表达?

答： 这个要看需要，一般情况0.01以下就可以认为不表达

问6：设计Q-PCR引物验证是不是很难？

答：一般不是很难。

问7：H3K4ME1，H3K27AC ,高富集的区域，会不会可能产生lncRNA ？

答：当然可能。

问8：从RNAseq或miRNA测序结果中能够预测出lncRNA么？

答：miRNA有难度， RNAseq可以。

问9：lncRNA序列里面好像有很多连续的相同碱基，对设计引物没有影响吗？

答：当然有影响了，gc含量高了，引物的退火温度也要高，不容易结合

问10：已知lncRNA下载怎样的格式啊?

答：没有固定的格式，比如fasta、gtf、gff之类的都可以用。

问11：测序出来的结果包括lncRNA和mRNA，那是不是测序的数据量要比普通的mRNA测序要大？

答：是的。目前大部分测序公司推荐的lncRNA测序量是10g。推荐测10g有2个原因吧。第一个原因，因为毕竟同时测lncRNA与mRNA本身信息比较大，自然需要更大的数据量；另外lncRNA表达量相对低一点，所以需要测到lncRNA的话，理论上就需要更深的数据量。但同时有个问题，因为测lncRNA是采用去核糖体RNA的方法，去核糖体RNA的方法无法保证能够把核糖体去得干干净净的，所以最后的测序数据里面都会多多少少比较多的核糖体的残留，那意味着我们有效的数据就偏少，所以需要比较大的数据来保证有效数据。就是说测得多才能保证剩下的数据是足够的。

问12：怎么发现新的lncRNA？

答：组装→算法→进行预测

问13：为什么不用phyloCSF？

答：首先使用范围比较窄，phyloCSF更适用于哺乳动物。其次是phyloCSF原理是经验密码子模型，只适用于特定区域内的编码。

问14：共表达模块分析样本量需要多大才跟可靠？

答：18个，一般12个我们也可以做。

问15：对于那些lncRNA表达量大，而它的靶标表达量小，这种也算共表达吧？

答：共表达并不是指的表达量，而是表达趋势，当然量太小也没有意义。

小圆

问16：做差异分析用什么样的软件，比如差异MRNA基因集合LncRNA基因集？我有两份数据，mRNA的和lncRNA的芯片结果，怎么结合找到共同的相关基因呢？

答：有2个方法。样本多，样本多用wgcna；样本少，用相关性。

问17：我的样本有四组，每组3个样品，可以做WGCNA吗？我的样本是4还是12呢？

答：这属于4个处理，12个样本。样本量偏少，我们不建议分析。

问18：水稻好做lncRNA吗？

答：应该来说是比较好做的。因为水稻的参考基因组质量比较好。所以做水稻lncRAN还是比较容易的。

问19：lncRNA可以在原核中做不？                     

答：纯分析的角度是可以的。但是目前我们接触到的文献关于原核生物lncRNA的报道还比较少，所以说在原核生物上做lncRNA还是有风险的。并不是说不能做，而是说担心没有或很少。另外，我们都知道用原核生物来做转录组的话本身就是去核糖体的策略，因为原核生物编码基因也没有poly-A尾结构，所以如果你做原核转录组测序的话，也是可以顺便分析一下lncRNA，这个是没有问题的。

问20：请问，针对含有病菌的叶片组织，能否有效去除或者区分病菌的lncRNA？能否一个同时针对病菌和植株进行lncRNA分析？

答：嗯，这个问题问得挺好的。因为这个也是病原宿主互作经常遇到的问题。理论上来说，你的叶片是有病菌感染的，做了测序之后是可以将病原与宿主的基因测出来的。不过最大的问题是，微生物的基因丰度会非常低。这里分析的话有2个难点，一个是必须保证微生物的丰度基因足够多，那意味着你取样要很准，如果取样不准的话，你取样组织里面大量是健康的植物细胞，只有一部分是有微生物感染的，那么在你最后提的RNA里面，微生物的基因丰度极低，极低的话意味着你通过测序的话，病菌的RNA将检测不到或检测太低，那么表达量的信息就不准，所以第一个就是这个微生物问题。

然后第二个问题是，能够有效区分、去除病菌的lncRNA，去除病菌的lncRNA的话意味着病菌要有参考基因组，如果没有参考基因组，也就没有办法对病菌lncRNA进行分析的。

问21：cuffdiff和edger在处理重复样的时候的差别是什么，最后的表达量是怎么得到的？

答： 没啥差别。统计算法都一样。差别在于处理基因的不同转录本的reads分配。

问22：许多lncRNA与mRNA是有重叠的，因此在设计引物做RT的时候，是不是要避开这部分重叠的部分？

答：这个问题也问得非常好，我们认为由2种情况，第一种lncRNA与mRNA如果在反义链上还好，比如一个在正链上，一个在反链上，因为有5‘ 3’，所以这个设计引物是没有问题的。如果是第二种情况，应该找两种序列特异的部分设计引物。

问23：lncRNA表达量很少的话如何做蛋白预测和pulldown实验？

答：应该是lncRNA表达量很少的话做polldown实验难度是很大的。但是我们目前看过的文章，lncRNA做验证的话都会挑表达丰度比较高的，因为表达丰度低的做实验难度比较大。

问24：我看过一篇文章，作者从单核糖体和多核糖体上分离RNA来做测序，只发现一个lncRNA，这种数据准吗？

答：这个问题很难回答。因为现在核糖体相关的RNA测序也是目前比较火的一个技术。目前这个技术更多的是研究与核糖体结合的mRNA。目前做过转录组和蛋白组关联分析的老师应该清楚，他们之间的转录组与蛋白的关联是非常差的，因为目前蛋白质谱的技术不怎么稳定，所以定量不是很准；另外从mRNA到蛋白中间经历了很多转录或修饰等等变化，所以蛋白的表达量与mRNA的表达量相关性很差，所以目前采取核糖体mRNA来测序的技术。据文献报道这种测序技术，结果是与蛋白相关性很强的，因为，既然是mRNA结合在核糖体上，那么基本上认为是可以翻译的。但是如果说找到一条lncRNA，这个到底准不准不好说，也有可能吧。因为lncRNA功能很多，在某些情况下是可以翻译一些小肽的，所以我认为说分离出lncRNA是正常的。

问25：老师，怎么用R做出主成分分析的结果和图？

答：使用主成分分析的模块gmodels，里面有例子介绍如何使用。

问26：你好，我想问问，想做一个药物对肿瘤细胞作用的机制探讨，是做基因组学还蛋白组学好？

答：做药物代谢的话，先入手的话，因为目前蛋白组学不是很成熟，除非你有明确的目标，某个药物会影响某个蛋白，如果这样的话可以做蛋白，如果不是，我们建议从基因组转录组入手，因为目前蛋白组研究还不是很成熟，可以鉴定的蛋白会比较少，另外误差也比较大，所以做基因组学会比较好一点。

问27：能讲一讲关于lncRNA和micrRNA相互作用，以及lncRNA二级结构预测的生物信息学方面的内容吗？

答： 其实目前从文献报道来看micrRNA与lncRNA的作用机制，其实就跟micrRNA靶向mRNA机制是类似的，其实这种靶向更多是种物理现象，只要他们结合就会作用。所以这种靶基因预测跟mRNA靶基因预测没有大的区别。从生物学角度来看，就是ceRNA看，lncRNA会把microRNA吸附走了，自然microRNA丰度下降了，自然对microRNA起保护作用。

我们看到比较多的是预测发夹结构的，很少是软件是预测二级结构的，所以你可以去找一下更复杂的一些软件。

问28：老师做蛋白质组处理1h，蛋白来得及表达吗？？

答：我觉得你这个问题是很难回答的，因为有些基因是很快表达的，有些基因是需要10h表达的，所以建议查看一下文献，因为生物应答时间有长短。

问29：我的链特异性文库，在用tophat比对的时候，我没有设置链特异性的参数，对后续分析影响大不。

答：影响不大，但如果是分析lncRNA的话，那就影响就大了。

问30：拼接是用cufflinks么？如果cufflinks拼接出来的结果中发现延长了某些基因的转录本，而这只是因为已知的基因注释不正确，是否会被误认为是lncRNA与mRNA重叠的情况？

答：是的，如果你不关心antisense，只关心基因间的lncRNA。

小圆

问31：ceRNA机制是不是不好做？

答：其实从生物信息分析角度来说，不难。

问32：lncRNA和miRNA共表达分析，据说不靠谱，不太可信，是不是这样？

答：我的观点是，所有的生物信息分析都是预测。这个不靠谱取决于样本量，样本量越少假阳性越多，样本量越多假阳性越少。然后是后续的数据解读吧。

问33：那如果一个物种即做了转录组，又做了蛋白组，怎么解释和取舍？

答：不同的分析使用不同的算法，取舍不一样。我的建议是，整体还OK的话，就写一篇文章吧，但如果一致性真的很差的话，那么你就写2篇文章吧。

问34：老师计算FPKM值时用的unique-mapped-reads，与计算测速深度时coverage表格里的unique-mapped-reads的unigenes数与compare里对应样品的FPKM大于0的unigenes数应该相等吗？

答：一般不会相等。

问35： 计算FPKM时计算的是那些unigenes的FPKM呢？为什么和计算测序深度的unigenes不是一样的呢？

答：因为一般低表达的基因会被舍去啊，像某些软件计算fpkm就会认为不表达。计算深度的每条reads都会计算。

问36：线虫做ceRNA好做吗？

答：应该挺好做的。从分析角度来说不是很难，但是后期实验来说是不好做。

问37：如果测序长度和cufflinks默认参数不一样，并且也没有专门设置，会后影响后面结果嘛？

答：不会。因为cufflinks会自己计算长度，不需要你来计算。

问38：请问拼接是用cufflinks么？如果cufflinks拼接出来的结果中发现延长了某些基因的转录本，而这只是因为已知的基因注释不正确，是否会被误认为是lncRNA与mRNA重叠的情况？

答：更有可能是可变剪切，5‘到3’波动是很大的，所以这完全是种正常的现象。

问39：低丰度的lncRNA功能比较难做，那么表达量多高的lncRNA值得我们挑选来做呢？我看 H19 表达量也不高，1.4。

答：尽量选择RPKM值大于10的来做，或者后续实验来说的话，建议挑表达量高的来做

问40：在转录组数据中，通过后续分析发现unigene里面有内含子，并且有些unigene很长，有超过10000bp，怎么会这样呢？

答：如果unigene超过10k，这个很有可能不是RNA，很有可能是DNA残留，是一条DNA序列，也有一定可能是mRNA前体，但很大可能是一段DNA序列。

问41：如果找到一个lncRNA，如何找到下游靶点来做呢？

答：建议找到lncRNA的话，建议优先从顺式作用考虑，看看周边有没有有意思的mRNA，不过总体来说从lncRNA来找mRNA会比较困难。可能需要双方面来找，建议先别确定某个lncRNA，可以挑几个表达量比较高的lncRNA，再看看周边有没有有意思的mRNA，然后再确定lncRNA来找下游靶点。

问42：为什么找lncRNA 周围的？

答：因为靶基因太多了，所以挑选周围的，从顺式作用考虑，让筛选更容易。

问43：转录组差异有1万多个，怎么会这么多差异基因呢？

答：总基因有多少呢？

问：5万

答：一般情况的差异10%不算大，如果加上组织特异性，20%~30%也不算不对。所以要根据你的样本实际情况来判断。

问44：lncRNA结合蛋白的motif可以分析吗？

答：应该挺难的，如果你知道怎么分析可以告诉我们。

问45：我们发现网上公布的一个基因的启动子拼接顺序好像有错误，上游启动子的序列好像接到下游了。这样我们还能做免疫共沉淀吗？？

答：既然发现有错误，想做这个基因的话，做下PCR实验，把序列扩出来，再做免疫共沉淀。看到基因组组装有错误是很正常的现象。

小圆

问46：现在做DEG测序 做10M够吗？ 样本是小鼠肿瘤组织？

答：这个样本量是够了。

问47：老师，看了贵公司的产品目录，有lncRNA二级结构分析预测、共表达网络预测功能，lncRNAs与mrna反向互补三种分析，每种分析需要哪些数据？还有没有其他的数据分析服务提供？

答：目前这些分析都是针对lncRNA测序的，如果做共表达网络的话，建议8个或8个以上样本。哪些服务我们很难回答，主要是看你的样本、实验目的、生物学背景等等来确定分析方案。

问48：lncRNA的转录起始位点可以通过生物信息学预测吗？

答：可以分析。

问49：转录组数据中很多是跟基础代谢相关，是不是这部分数据分析意义不大？

答：如果你的实验涉及到与基础代谢相关，那么这部分数据就有意义。但如果你的实验处理没有涉及到就没有意义。所以说，还是需要跟你的实验背景相关。

问50：基迪奥有没有涉及到ncRNA的调控网络方面的研究？

答：有的，一般都是跟mRNA进行关联。

问51：GO分析里的代谢过程和KEGG的通路以及mapman之间的差异是什么呢？

答：其实GO与KEGG是两个独立功能注释数据库吧。两个数据库都是做功能注释的。两个的区别主要是数据上的区别，比如KEGG在代谢通路上做得最好的数据库，GO是做功能分类数据库的。然后mapman是一个分析软件，用的GO数据库结果，是做用来分析GO数据库的，然后它画的图比较漂亮。

问52：我在目的基因的互补链上发现一个疑似lncRNA，请问该lncRNA是不是针对该目的基因的？

答：建议做一个qPCR实验，可以将lncRNA与宿主的做一个表达量定量，看看是正相关还是负相关，如果相关的话，可以做一个干扰实验，看看宿主基因是否发生变化，以及宿主细胞表型是否有变化。

问53：那一般如果要做RT验证的话，筛选RPKM值多大以上的能够验证出来？

答：这个实际上越大越好，之前我做的项目最小10rpkm可以检测到。

问54：那一般如果要做RT验证的话，筛选RPKM值多大以上的能够验证出来

答：一般看实验方法和需要，10rpkm或者1fpkm都能验证出来。当然，表达量越高，验证率也越高。

问55：0.01-0.1之间的lncRNA通过RT-PCR能验证出来吗？

答：很难了。

问56：go的代谢谢过程也可以理解为KEGG的通路吗？

答：其实GO的数据比较全但是比较粗糙，KEGG的比较窄但是比较精细。实际做项目的话，可以两种结合，互补结合的效果。

问57：链特异性建库和非链特异性建库，对于后续分析有什么影响？？

答：有影响，可以区分正负链信息，比对更加准确。

问：正负链信息？是说反义转录组？

答：是的，可以这么理解。

问：那么通常是建议做正义链还是反义链？

答：不是正义链和反义链，链特异文库一般用来看reads是从哪条链上出来的。

问：较于之前的非链特异性建库，现在的链特异性建库，在分析上也没有什么差别吧？

答：分析上没有大的差别。

问58：一般除去外源污染reads有什么方法？

答：2种策略，如果外源污染是确定的，并且是有参的，就注释去掉。

如果不知道是哪种污染，直接做拼接，与微生物库及NR数据库比对，然后进行打分，比如那种打分更高就认为是该种基因，然后再进行去掉。

问59：老师，linc，sense和antisense都能识别吗，具体怎么识别啊？

答：都能识别，用链特异文库就可以。

问60：那sense和antisense在估计表达量的时候是使用的cufflink计算的结果吗？

答：是的

问61：Nr注释结果一条序列对应很多结果，后面该如何处理?

答：blast之后，挑一个打分最高的，打分最高的视为同源序列。

问62：cis作用的话一般lncRNA的上游还是下游？

答：不一定。可能是上游也有可能下游，上游会多一点。

问63：我打算做itraq请问我做的全谱分析里面是否包含磷酸化蛋白组的分析？那我如果要分析差异磷酸化蛋白，该怎么办？

答：以我们的经验来讲，不建议分析，因为这个分析结果是非常不可靠的。而且用itraq来分析蛋白磷酸位点非常不可靠，目前我们公司分析里面是不带这条分析的。

问64：蛋白组要不要做重复？

答：我们实话实说，要发高分文章，要做重复。但如果想发一个3、4分左右的文章，可以不做重复，因为蛋白重复性并不好。

问65：trinity组装后的gene ID怎么看？（下图）

                             

答：这个是基于基因组的组装，第一个是染色体信息，第二个是clust ，第三个基因，第四个isoform

问：那么通常说的unigene是指第三个ID？

答：是的。

tom1234

总是走在前端

leo

谢谢 非常有帮助

Minghua Liang

藻类也能做长非编码RNA的研究吗，有啥研究意义呢

小圆

Minghua Liang 发表于 2016.4.7 20:35
藻类也能做长非编码RNA的研究吗，有啥研究意义呢

有参考基因组就可以做lnc

wangzhaoyi

感谢分享

flysky668

very nice！

Alvin

老師，請問沒有參考基因組可以做lncRNA嗎？

xkma

过于简单，有更深入点的材料吗？

chuankang17

感谢万能的群

bioinfomics

很有用的总结

daiwenting

一般物种中能够鉴定的LncRNA数目有多少？

小圆

daiwenting 发表于 2016.6.27 17:32
一般物种中能够鉴定的LncRNA数目有多少？

一般在数据库中模式生物的比较多，具体的因物种不同而不同，同时lncRNA 有组织特异性和时空特异性，因此同一个物种在不同组织或者不同的发育时期也可能不同。

梦海

感谢分享

zyr258

lnc转录本的平均长度比mRNA都要短吗

ywk

都是干货，有待操练

Chongsong

谢谢分享