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16S+宏基因组揭示群落物种和功能的共同响应机制

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发表于 2022.11.23 09:47:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
微生物群落研究,最根本的目的是找到疾病与健康、处理与对照……等表型差异的驱动因子,进而揭示相应的分子机制。为了达到这种目的,常通过①理化因素②生物分子实验③微生物数据④个性化分析⑤多组学关联分析(图1),这5种手段组合来进行数据挖掘。根据研究目的不同,上述五种要素可进行随意组合,那如何合理搭配要素,以解决相关生物学问题呢?

带着疑问,我们开启基迪奥群落应用的第7篇文章,这篇案例采用的是典型的“微生物+微生物功能”的研究思路,由16S提供物种数据,宏基因组提供功能数据,成功构建了宿主-微生物-植物关联模型。作者主要通过②生物分子实验和③微生物数据来对本文进行挖掘。

图1 微生物群落的五种研究手段


  • 客户单位:浙江农林大学
  • 影响因子:16.837
  • 发表期刊:Microbiome
  • 发表日期:202206

研究背景

草食性昆虫从多种来源获得肠道微生物群,这些微生物在昆虫宿主对植物次级防御化合物的耐受性中发挥着重要作用。山茶象(Curculio chinensis) (CW)是油茶植物的专性种子寄生虫。而山茶象中的肠道微生物群是来源于果实还是土壤中?以及参与TS(油茶中茶皂素)耐受性的关键细菌和这些细菌的降解功能都未清晰。

实验取材

16S:选取浙江青田、衢州和建德三个种植园的5个油茶C.oleifera无性系(cl3、cl40、cl53、cl55和cl166),同时采集各无性系土壤、新成虫和果实样本,最终共收集270对成虫、90个土壤和90个果实样品进行16S测序。

宏基因组:用含5g/L TS的水溶液处理土壤,并将水溶液喂CW新成虫,每隔12小时采集一次。每个时间点取土壤样品三份,每次取9对成虫肠道样品,混合成三份样品。共取了6个时间点的样本进行宏基因组的测序。

要素组合策略:
☑生物分子实验
☑微生物数据

研究结果

一、微生物数据(16S和宏基因组)

1. 16S揭示CW肠道菌群与周围环境菌群的差异

①群落β多样性分析

基于Bray-Curtis距离的PCoA分析,发现土壤、肠道、果实样本各自聚集。并且通过Anosim(R>0.5,p<0.05)和Adonis(p=0.001)检验来看,三个分组之间的菌群差异具有统计学意义(图2d)。

②指示物种分析

先通过随机森林在属水平上识别土壤、果实和肠道样本的指示类群,结果发现沙雷氏菌属(Serratia)和不动杆菌属(Acinetobacter)是肠道和土壤菌群的核心成分,而Aquabacterium在果实和土壤群落中很重要(图2e)。

接着,又通过富集三元图评估肠道微生物和周围环境(如土壤和果实)微生物群之间的关系。发现,水果和肠道菌群表现出比土壤更接近的相似性,土壤特有ASV较少(图2f)。并挑选对整个模型贡献度最高的10个属作为潜在的生物标志物(图2g)。

以上结果表明肠道菌群与水果和土壤的群落不同,且受环境影响!

图2 16S揭示肠道菌群与周围环境菌群的差异

2. 16S追溯CW揭示肠道菌群的来源

接下来探究肠道菌群的来源,建立了微生物菌群源模型(SMM),结果表明,与果实菌群的影响相比,肠道微生物群受土壤菌群影响更大(图3a,c)。

在排除果实对CW肠道菌群的影响后,对土壤和成虫肠道菌群以TS作为唯一的碳源进行体外培养。结果从肠道中培养出5种细菌,土壤中4种(图3d)。并且离体培养结果与上述三元图和随机森林具有相同的重叠结果(图2e-g)。不动杆菌([AS23]、[T4])在肠道和土壤中最常见(图2e-g)。

图3 肠道菌群的溯源分析和可培养分离物16S rRNA基因的系统发生树重建

3. 16S揭示TS含量对CW肠道和土壤菌群的影响

此步主要研究介导CW减轻TS毒性的细菌类群。在TS含量较低的T55、T53和T3根系土壤中,Aquabacterium的相对丰度最高;TS较高时则Acinetobacter具有高丰度。相比之下,成虫肠道(C55、C53和CC3)中Serratia最高(图4a)。另外PCoA分析显示肠道和土壤的菌群结构不同(图4b,c),表明植物无性系中微生物组成可能受TS含量影响。进一步分析发现,TS含量高(T166+T40)和低(T55+T3和T53)的土壤菌群之间存在差异(图4d,e)。与其他样本相比,喂食高TS植物的肠道菌群显著富集Proteobacteria变形菌门(Pseudomonas假单胞菌门、Acinetobacter不动杆菌门等)(图4f)。并且相关性分析结果显示不动杆菌的丰度与TS含量呈正相关,Burkholderia呈负相关。

图4 不同TS含量的油茶无性系栽培土壤和肠道微生物群落结构差异

4. 宏基因组揭示TS降解对土壤和CW肠道菌群结构和功能的影响

①土壤和肠道菌群结构分析

基于宏基因组时间梯度数据,又表征了TS降解对土壤和肠道菌群结构的影响。结果发现TS含量对群落多样性(即Shannon、Simpson、Chao1指数)和网络复杂性(即平均度越高代表网络复杂性越高)具有强烈影响(图5a-d)。从TE群落(24 h,平均程度69.37)到TM(48h,平均程度11.6),再到TL(72 h,平均程度10.33),细菌丰富度和网络复杂度逐渐降低(图5a,c)。可见TS含量对土壤微生物群落的影响较为严重。另外,CW肠道菌群对TS降解和土壤一样,细菌丰富度和网络复杂度也是随时间逐渐降低(图5b,d)。此外,CL和其他两个网络的组成不同,前者不动杆菌的节点更多(图5b)。

上述结果表明,不动杆菌是肠道和土壤微生物群落中TS后期降解的主要细菌类群之一!

图5 TS降解过程中土壤和肠道微生物群落变化的宏基因组分析

②土壤和肠道菌群功能分析

随后又进行了功能分析,发现TS降解后期(TL)和早期(TE)土壤中显著富集的通路有20个,被分为6个大的功能群,其中与代谢相关的10个通路差异最大(图6a),并且这些途径大多与有毒物质(高分子量碳化合物)的降解有关。同样,在TS降解后期,肠道微生物组也是代谢通路为主,有18条通路富集,且大部分与毒素降解相关。
并通过桑基图对不动杆菌基因组中富集的KEGG通路进行评估,结果发现共有40条通路显著富集,其中很大一部分通路与肠道和土壤中TS降解后期阶段有关(图6c)。特别是次生代谢物的生物合成、碳代谢等。表明不动杆菌群参与了高分子量碳分子的分解(图6c)。

③不动杆菌AS23对TS的降解分析

选取AS23作为目标菌株,探讨不动杆菌对TS的降解作用。发酵液中TS在12 h后的峰值面积与对照(CK)差异显著(图6d)。发酵时间延长导致TS峰面积减小。此外,对接种AS23的幼虫肠道分析发现,幼虫粪便中TS的检测含量为277.944±6.044AU·S,与CK相比也有显著差异(图6e)。

图6 基于宏基因组分析TS降解过程中不动杆菌的功能

二、生物分子实验

不动杆菌菌株AS23介导幼虫对TS毒性的耐受

US和SSA处理组在羽化后的成年CW表现出不动杆菌特异性基因序列的扩增(图7a)。在SSA处理组中,荧光AS23细胞存在于成虫肠道中(图7b)。卵孵化后,幼虫取食导致产卵孔中获得荧光标记的AS23,因此在幼虫肠道中检测到荧光AS23(图7c,d)。相比之下,SS处理组无法检测到荧光(图7e,f)。孵化后,US处理组幼虫数量和体重显著高于其他两组(图7g,h)。随着幼虫的发育,SSA和US处理组幼虫之间的差异迅速缩小,成熟幼虫几乎完全相同(图7g,h)。

以上表明AS23菌株在TS的快速降解中起关键作用,并帮助幼虫减轻TS的毒性!

图7 实验分析表明,土壤中的不动杆菌AS23介导了CWs对TS毒性的适应

#CK处理:无菌水。SS处理:化蛹附近的幼虫在灭菌土壤中饲养。US处理:蛹附近的幼虫在未灭菌土壤中饲养。SSA处理将蛹附近的幼虫在与荧光标记不动杆菌AS2细胞混合的无菌土壤中培养

本文点评本文的亮点在于作者很好的利用了微生物数据,通过16S和宏基因组两种测序技术从物种和功能两个层面成功构建了宿主-微生物-植物的模型,揭示了CW主要受土壤菌群影响,以及参与TS耐受性的关键细菌是不动杆菌群,并且这些菌群具有高分子量碳分子分解的能力。后续又补充上分子生物实验,证明了是不动杆菌菌株AS23介导了幼虫对TS毒性的耐受。本文从物种、功能、分子实验层层递进,使文章极具参考价值。

参考文献

Soil-derived bacteria endow Camellia
weevil with more ability to resist plant chemical
defense


*未经许可,不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有,侵权必究。


本文作者:基迪奥-潇潇

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