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质谱检测,你需要知道的原理和参数

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发表于 2022.7.28 09:22:49 | 显示全部楼层 |阅读模式
相比于表观修饰、转录、翻译过程,处于转录下游产物的蛋白质、代谢物往往具备更强的表型解释能力,这两个组学也常作为上游调控机制(如:基因的转录、翻译过程)的延伸,将基因调控与表型响应关联起来,多角度阐述表型差异的内在调控机制。

不同于具有A、T、C、G、U碱基序列信息的DNA、RNA。蛋白质、代谢物则是由元素(C、H、O、N等)构成的立体化合物,想依赖测序技术获得大量的蛋白质、代谢物种类和丰度信息,目前较难实现。主要原因在于:1.部分蛋白质无特异性抗体,会缺失无抗体的蛋白质信息;2、利用算法将序列信息转化为氨基酸时,会存在部分“翻译”错误;3、代谢物本身没有序列信息。为更全面的量化这两种物质在样本中的表达特征,色谱-质谱(GC-MS、LC-MS)联用技术则广泛使用在蛋白质组和代谢组研究中。利用色谱柱的高效“聚类分离”能力和质谱仪准确“打谱鉴定”化合物的手段,实现样本中蛋白质和代谢物的全面检索。后期结合数据库(uniprot、HMDB、mzCloud等)实现物质种类注释。

随着色谱仪-质谱仪检测仪器的不断升级,其对物质的检出和定量效果不断提升。面对多种色谱类型以及更多样的质谱仪,明确其内在的原理和参数才能在众多质谱仪中不迷失方向,选择性价比更高、更合适的仪器。

转录下游产物的鉴定流程

首先,下游产物的预分离主要在色谱中完成。

色谱“聚类分离”

由于物质种类多样,还存在同分异构的情况,当有上千种或上万种具有不同结构的蛋白质或化合物进行检测时,如果将其直接上样到质谱仪中,无疑会给质谱检测带来巨大压力,往往表现出离子间的相互抑制、谱图复杂难以解析等难题,导致检测到的物质会少。会与我们想尽可能多的检测蛋白质、代谢物的目标相背离。为了解决这一问题,目前常用的手段则是在质谱仪检测前串联一个色谱装置。

色谱(chromatography),又可称为色层法或层析法,类似于薄层层析法。从样本中提取到蛋白质或代谢物溶液后,进一步注入到色谱仪中。由于物质的理化性质、极性、非极性等特征,当其流过色谱仪中的色谱柱时,在色谱柱中的停留时间不同(图1)。根据这个“时间差”,可将复杂的物质进行初步预分离,即实现将具有相似极性特征的物质聚集,不同性质的物质分离的效果。完成这一步之后,再对不同时间点收集到的物质分别上机检测,质谱仪的检测压力就会小很多,离子间的抑制效应得到极大改善,检测到的物质种类有明显的提升。

因为分离过程主要在色谱柱中完成,色谱柱的类型、性能可直接影响“聚类分离”效果。对于挥发性气体物质的检测往往使用气相色谱柱(Gas chromatograph,GC),非挥发性物质则更多使用液相色谱柱(liquid chromatograph,LC)。这两种类型的主要差异在于色谱柱中的填料不同。

除了分离功能外,色谱仪同时配备检测系统,记录每类物质在色谱柱的保留时间(RT)、峰强度等信息,便于辅助后续的物质鉴定。

图1 色谱柱基本分离原理图

Tips
对于内源性大分子-蛋白质而言,因具备盘曲折叠结构,不利于直接检测,往往在进行色谱前会对样本进行酶解,形成小片段的肽段后再进行色谱分离;对于内源性小分子—代谢物,提取完代谢物后可直接进行色谱分离。

质谱“打谱鉴定”

色谱的主要功能是对蛋白质、代谢物的预分离,想要获得其真面目,看清它们是谁还需借助质谱仪的力量,经质谱仪“打谱”功能,获得物质的质谱图、质荷比(m/z)再结合色谱中的RT信息,与数据库中收录的m/z、RT、离子强度(Intensity)进行比对,根据比对打分值实现最终的物质定性。因此,如果说色谱是“聚类分离”,那质谱就是“打谱鉴定”过程。

为了获得更准确的m/z,离子信号强度(Intensity)等信息,其性能尤为重要。质谱仪主要由三部分组成:离子源、质量分析器、离子检测器。

离子源主要起电离的功能,可轰击由色谱分离的各组分物质,使其带上电荷,形成具备不同质荷比的带电离子,经加速电场的作用,形成离子束进入后续的质量检测分析器中检测。根据电离的方式不同,可分为电子轰击电离源(Electron Ionization,EI)、电喷雾电离源(Electrospray Ionization,ESI)、基质辅助激光解析电离源(MALDI)等。

电子轰击电离源(Electron Ionization,EI)

EI比较适用于相对分子量较小(<600)的中性有机分子的电离,这些分子往往在不分解的情况下用于气相分子检测,气相分子进入离子源,受到灯丝发射的自由电子的轰击。电子轰击后,导致硬电离的产生,分裂分子,使分子成为带正电荷的粒子。由于更适用于气相分子的检测,常用于GC-MS实验中。

图2 电子电离源(EI)示意图

电喷雾电离源(Electrospray Ionization,ESI)

ESI过程大致可分为液滴形成、去溶剂化、气相离子的形成3个阶段。样品溶液(A)通过雾化器进入喷雾室,同时雾化气体(如N2)通过围绕喷雾针的同轴套管进入喷雾室。由于雾化气体强的剪切力及喷雾室上筛网电极与端板上的强电压(2-4Kv),将样品溶液拉出,并将其碎裂成小液滴。随着小液滴的分散,在静电引力的作用下,一种极性离子移到液滴表面,样本被载运并分散成带电荷的更微小液滴。在干燥器-氮气的逆流作用下,液滴的直径随之变小,液滴表面电荷密度增加,当达到极限时,液滴发生爆裂(Columbic repulsion)。随着液滴的不断爆炸,裸离子从液滴表面发射出来,转变为气体离子进入后续检测。

ESI的优势主要体现在可用于生物大分子检测的同时,对高分子量的分子通常会带有多个电荷,电荷状态的分布可以精确对分子量定量,并提供精确的分子质量和结构信息。而且检测时间短,提供正离子模式ESI(+),负离子模式ESI(-)检测,还可与各种色谱联用,用于复杂体系的分析。目前,蛋白质组和LC-MS/MS的非靶向、广泛靶向代谢组常用该方式进行电离。

图3 电喷雾电离源示意图

基质辅助激光解析电离源(MALDI)

MALDI电离中,样品首先与大量过量的基质化合物(CHCA、DBA等)形成共结晶,之后通过激光照射形成基质电子。该方式同样区分正离子模式(pos)和负离子模式(neg)。目前常在空间代谢的检测中发现其身影。在《空间代谢检测参数知多少?》有做过详细介绍,这里就不过多赘述。

经过电离源离子化后,带电离子会进一步进入质量分析器进行离子特征的检测,如m/z、离子强度等信息,是后续确定物质类型的关键!也是QE HF-X、Orbitrap Fusion™ Tribrid™(Fusion)、Lumos、QE等质谱仪差异的主要因素。

各种琳琅满目的质谱仪,主要是内核搭载的质量检测器不同。质量检测器的主要功能就是对电离后的离子按照质荷比进行分离。由于分离的原理不同,目前常用的分离方式主要有:四极杆(Quadrupole,Q)、飞行时间(Time of flight,TOF)、离子阱(ion trap)、轨道阱(Orbitrap)等。

在介绍质量分析器之前,先明确几个常见评估指标;
a.准确度(accuracy):指离子测量的准确性。一般用真实值和测量值之间的误差进行评价,单位ppm(part per million);
b.分辨率(Resolution):是指质谱仪区分两个质量相近的离子的能力。分辨率越高,准确度越高;
c.灵敏度(sensitivity):是指检测器对一定样品量的信号响应值,即最少样品量的检出程度。

这三个指标是判断质谱仪等级的关键参数,对物质检测准确度,检测种类有较高影响,可以说直接影响了最终的定性定量。

四级杆(Quadrupole,Q)

四极杆分析器(图4A)是由四根圆柱形金属棒组成,两根接正极,两根接负极。通过切换直流和交流电压控制离子在四极杆内运动,一边飞行,一边转圈。当扫描电压和频率一定的时候,只有特定m/z的离子才会显示出稳定的轨迹,进而传输到检测器中获得离子的m/z值,其他离子就会因偏转太多而打到四极杆上。通过实时改变直流和交流电压,将具有不同m/z值的离子一个接一个的传输到检测器中。四极杆分析器分辨率较低,准确度不高,但稳定性好,数据重复性高且精密度高。适合分析较为简单的样品,或者复杂样本靶向检测和定量。

飞行时间(Time of flight,TOF)

飞行时间分析器(图4B)由脉冲离子源、加速栅极、无场飞行管和检测器组成。在相同加速电压的作用下,根据被加速后的离子经过无场飞行管到达检测器,由于所有离子的初始动能是相同的,重的离子飞行速度会慢一些,轻的离子飞的快,不同m/z的离子到达检测器的时间不同,可根据时间来计算离子的质荷比。TOF具有最快的扫描速度和最宽的分子量检测范围,较四极杆而言,其灵敏度,分辨率、分子量检测范围都有所升级。同时,气相色谱和液相色谱都可与之对接,使用场景更多样。

线性离子阱(ion trap)

线性离子阱分析器(图4C)横截面比较类似于四极杆,在电流电压下可使离子一直保持在离子阱中心运动,通过调节电流电压,特定离子会被弹射出来用于后续的碎裂和质量分析。因此,离子阱同样具备特定离子的选择过滤功能。相较于四极杆而言,线性离子阱具有更大的离子容量和扫描速度,灵敏度和离子质量检测范围也得到提升。

轨道阱(Orbitrap)

轨道阱分析器(图4D)是一种静电离子阱。在轨道阱中,运动的离子被静电场捕获,在静电力的作用下,离子受到朝向中心点的静电引力作用,由于离子进入轨道阱时具备初始速度和角度会产生离心力。在静电引力和离心力双重作用下,迫使离子以螺旋模式运动。通过傅立叶变换(Fourier transform)获得不同质量离子的振荡频率,从而精确读取离子的m/z信息。相对于四极杆、TOF,其灵敏度和分辨率得到质的提升,分子检测范围也有所扩大。

图4 不同类型的质量分析器[1]

每通过一个质量分析器就是一个MS过程。在实际检测过程中,尤其对于非挥发性的物质检测,常常有多个质量分析器串联使用的情景。如LC-MS/MS就是指经液相色谱分离后的物质,在两个串联质量分析器的作用下完成母离子检测和子离子检测过程。之所以称为母离子和子离子,是因为两个串联质量分析器间会添加一个碰撞室(Activation cell),进行二次碎裂(图3)。因此,二次碎裂前的称为母离子(MS1),二次碎裂后的离子称为子离子(MS2)。

图5 串联质谱示意图

Tab1不同质量检测器汇总如下

Tips
质量过滤器可过滤特定质荷比的离子,可让特定的离子穿过四极杆,可用于目标离子的筛选;质量检测器用于检测不同质荷比的离子。

质谱仪的命名多直接用其质量分析器表示,如:

蛋白质组检测常用:HF-X/Fusion是四极杆与Orbitrap组合;Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 是四极杆、线性离子阱、Orbitrap共同组合;

代谢组检测常用:QQQ质量分析器,又称为三重四极杆,本质就是三个四极杆串联而成。可用于靶向代谢组和广泛靶向代谢组的检测;非靶的Q-TOF(图4B)就是由Q和TOF串联而成。

不同仪器搭配组合可适用于不同场景,也会影响最终的检测结果。如在仪器性能上:HF-X >Lumos>Fusion。(虽然HF-X和Fusion的质量检测器组成相同,但HF-X改进为大容量离子传输管,极大提高了离子传输效率并优化了扫描时间和灵敏度,其整体性能上要优于Fusion)

常用质谱仪类型—3D\4D质谱仪

近两年,在质谱仪更新换代的背景下,用于蛋白质组学检测的质谱仪可划分为两大类型:

1. 以QE HF-X、Orbitrap Fusion™ Tribrid™(Fusion)、Lumos为主的3D检测仪器,又称为3D-质谱仪;
2. 以赛默飞研发的Orbitrap Exploris 480、布鲁克研发的 tims TOF pro,tims TOF pro2为首的4D检测仪器,又称4D-蛋白质组学。

3D即指上文说到的,利用色谱-质谱获得的保留时间(Retention time)、质荷比(m/z)、离子强度(Intensity)3个维度的信息,辅助完成物质的定性定量。

4D主要是在3D的基础上增加一维离子淌度(ion mobility)信息,即离子迁移率的分离。该步骤可将离子按大小、形态、结构进行分离,从而降低检测难度,同时灵敏度、扫描速度也得到提高。由于可以区分三维结构,可实现同分异构体的分离和检测。

如,Orbitrap Exploris 480就是QE HF-X的升级改造,与3D QE HF-X不同的部分是,该仪器在ESI离子源部分与Orbitrap之间连接了一个高场不对成波形离子迁移谱仪(FAIMS,high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry),该仪器可以在肽离子离开ESI离子源并进入质谱仪之前对其进行快速有效的气相分离,以增加蛋白质组分析深度,因此对复杂样品的定性和定量效率较高。同时分辨率、灵敏度检测范围都得到提升。

tims TOF pro内核则是Q-TOF串联,但又不同于3D的Q-TOF,在进入四极杆之前会先进行离子淌度的分离获取CCS值(Collisional Cross Section:根据离子在运动时与缓冲气体碰撞的碰撞截面计算得到该值),同时在灵敏度、分辨率、扫描采集速度上均有所提升。在物质鉴定时使用ccs、 RT、m/z、Intensity四个维度的信息。

图6 3D、4D差异示意图

相比于3D而言,4D的主要优势在于:
①物质可区分同分异构体;
②样本用量减少,约3D样本的2/3。4D的检测灵敏度有所提高,可适用于微量样本、珍贵临床样本或用于多组学分析的实验样本,以节省样本;
③适用复杂样本的解析。如由不同组合混合得到的样本,其检测效果要优于3D质谱仪。但对于血清、血浆、动物常用组织等,3D也可满足检测要求,使用3D的成本更低。
④在相同检测机时下,4D质谱仪得到的蛋白质种类多于3D。或者在检测到相似数量蛋白质时,4D花费的时间更短。

当然,由于增加了一个维度的信息,4D的检测成本也更高。对于不需要区分同分异构体的实验或简单常规样本的实验(如:血清、血浆、常见组织),3D质谱检测已然能够达到检测需求,性价比更高。

目前,基迪奥可提供3D、4D蛋白质组检测以及QQQ和Q-TOF的代谢组检测。使用的也是最主流、最新、高效的质谱仪。保障您的质谱检测需求,限时好价咨询~

Tab2 4D蛋白组检测

Tab3 3D蛋白组检测

代谢组检测

参考资料:https://www.creative-proteomics. ... s-of-mass-analyzer/


本文作者:基迪奥-zero  

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