师弟师妹看过来，手把手教你设计miRNA引物！！！

zhaogan364

近年来测序很火，很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作，miRNA研究越来越火，然而，，，找公司设计引物合成引物真尼玛贵，（某玛 350一条，对于我们穷屌丝来说，，）然而，我们自己合成设计，就和普通定量引物价格一样，也么有什么要求，况且，生物公司也是用的这种方法，贵就贵吧，关键还不给序列，不给序列就算了，特么还是期货，，，（1-2周），简直坑爹！！一怒之下，本兄硬是自己动手琢磨了会，效果良好，哟西，，，，好了，如果你有土豪boss罩着，，，，，记得带我飞。。。。。
好了，不说了，首先介绍第一种：
1. 关于miRNA引物设计（茎环法）：

原理：由于mir在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦，，，

具体操作：

需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长mir的）+实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。

①逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。“特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。”5’端茎环结构通常固定，如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ；3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。

即：逆转录引物为“5‘- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’（N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基）

通俗的说就是： 固定的颈环序列（网上很多或者用我这个也行）+mir末端6-8个反向互补碱基

以 mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p  ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)     颈环序列+末尾 8个碱基反向互补：即为

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata

[size=13.3333330154419px]

②上游引物：包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。、
即：上游引物为5‘- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ，自miRNA5’端抄起，14-16个或13-14个

通俗的说就是：保护性碱基（用来调GC含量的）+mir 5 端的13-16个碱基（不要抄到最后那6-8个上去了，意思就是不要与RT那段重叠了）

③下游通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA -3’  （茎环引物上取，可以挪）这个就更简单了，直接在颈环上摞一段即可，然后计算下gc完事

方法二：
也就是我们传说的加尾法，这个好处在于可以批量处理，非常适合测序用户验证哦~~
由于这个设计非常机械，于是有人就专门设计了软件，被俺及时发现，挖掘出来，献给大家~~不谢~
好了，废话不多说，自己下载附件吧，附件里面把原理，原则，软件及其使用方法都说的清清楚楚，大家自行下载哦~~




哎呀，不容易呀，版主赶紧给我奥币~~~我的奥币。。。。。

zhaogan364

第二种方法的 附件下载地址：
https://yunpan.cn/cSHkTL3LZPNH8  访问密码 5342

版主补充：链接失效了，可尝试：https://sourceforge.net/projects/mirprimer/

引物设计问题软件：

1 http://mirbase.org/ 这个软件可以直接查询miRNA序列，真的非常简单。

直接把U换成T。就这样搞定了上游序列，下游序列是试剂盒自带的。内参的话在万能的丁香园找现成的序列。

2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 这个是检测所合成序列是否合格的软件。

3. http://haigene.cn/microrna_reagents.html）查询相对应的引物对。

4.完整详细的实验过程链接：https://wenku.baidu.com/view/e02c2b2ca6c30c2259019e58.html#

zhaogan364

软件太大，传不上来。。。我滴神，，

bestcg

感谢分享，感觉还是加A法方便些，就是kit贵了点。不知道楼主有没有好的方法检测pre-miRs，之前尝试过加A法，设计的引物扩增效率不高，然后就改用northern来检测了

xiaomaguohebjfu

各位大神，今天真是收获太多了，收下，谢了

zhaogan364

bestcg 发表于 2016.5.19 20:10
感谢分享，感觉还是加A法方便些，就是kit贵了点。不知道楼主有没有好的方法检测pre-miRs，之前尝试过加A法 ...

pre-mir 可以直接从mirbase 找到序列，它本身就有个颈环，有80来bp，所以你设计引物的话，就上下各取一段就可以的。

zhaogan364

xiaomaguohebjfu 发表于 2016.5.20 16:14
各位大神，今天真是收获太多了，收下，谢了

下次再发点别的，谢谢关注

xulei00100

，多谢了，正愁没有好的miR引物设计软件呢

小王同学

我滴个天呀 好

eason MA

问下楼主，有没有用过haigene的产品，效果怎么样

zhaogan364

eason MA 发表于 2016.6.6 11:18
问下楼主，有没有用过haigene的产品，效果怎么样

没有额 用过吉马的

initial

不管用不用得着，先谢谢楼主了！

Freecat

好好学习了。

yuanyi

谢谢分享

yuebanwan7

后期用，谢谢楼主分享！

yuebanwan7

http://www.docin.com/p-720311026.html
之前看过一篇相关文章，叫“microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明”
有兴趣的可以看看。但是文章中有个 DNAstar的软件，我在网页上搜了下 不好下载，
不知道楼主用过这个软件吗？

caffemao

感谢分享

yuanyi

受教了

ywk

感谢分享

andywang6137

不做miRNA，虽然看不太懂，还是觉得好牛掰