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师弟师妹看过来,手把手教你设计miRNA引物!!!

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钵水母

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发表于 2016.5.19 16:50:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

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近年来测序很火,很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作,miRNA研究越来越火,然而,,,找公司设计引物合成引物真尼玛贵,(某玛 350一条,对于我们穷屌丝来说,,)然而,我们自己合成设计,就和普通定量引物价格一样,也么有什么要求,况且,生物公司也是用的这种方法,贵就贵吧,关键还不给序列,不给序列就算了,特么还是期货,,,(1-2周),简直坑爹!!一怒之下,本兄硬是自己动手琢磨了会,效果良好,哟西,,,,好了,如果你有土豪boss罩着,,,,,记得带我飞。。。。。
好了,不说了,首先介绍第一种:
1. 关于miRNA引物设计(茎环法):

原理:由于mir在20bp左右,没法根据其设计引物检测出来,于是,人们就先将其延长,也就是先加一个环状片段,这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了,然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦,,,

具体操作:

需要三种引物:逆转录引物(RT-primer,用于延长mir的)+实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物

①逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。“特异的反向引物约42-44个核苷酸,其5’端的36个核苷酸序列是固定的,形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构,其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。”5’端茎环结构通常固定,如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ;3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。

即:逆转录引物为“5‘- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’(N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基)

通俗的说就是: 固定的颈环序列(网上很多或者用我这个也行)+mir末端6-8个反向互补碱基

以 mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p  ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)     颈环序列+末尾 8个碱基反向互补:即为
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata
[size=13.3333330154419px]

②上游引物:包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列,5’端通用序列为:5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’,用于延伸实时定量PCR产物的长度;3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。、
即:上游引物为5‘- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ,自miRNA5’端抄起,14-16个或13-14个

通俗的说就是:保护性碱基(用来调GC含量的)+mir 5 端的13-16个碱基(不要抄到最后那6-8个上去了,意思就是不要与RT那段重叠了)

③下游通用引物:5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA -3’  (茎环引物上取,可以挪)这个就更简单了,直接在颈环上摞一段即可,然后计算下gc完事

方法二:
也就是我们传说的加尾法,这个好处在于可以批量处理,非常适合测序用户验证哦~~
由于这个设计非常机械,于是有人就专门设计了软件,被俺及时发现,挖掘出来,献给大家~~不谢~
好了,废话不多说,自己下载附件吧,附件里面把原理,原则,软件及其使用方法都说的清清楚楚,大家自行下载哦~~




哎呀,不容易呀,版主赶紧给我奥币~~~我的奥币。。。。。




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Eric_Young + 4 Good job!
小圆 + 10 很好的分享啊
taojun7054602 + 6 + 2 赞一个!

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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.5.19 16:54:27 | 显示全部楼层
第二种方法的 附件下载地址:
https://yunpan.cn/cSHkTL3LZPNH8  访问密码 5342
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.5.19 16:50:46 | 显示全部楼层
软件太大,传不上来。。。我滴神,,
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钵水母

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发表于 2016.5.19 20:10:01 | 显示全部楼层
感谢分享,感觉还是加A法方便些,就是kit贵了点。不知道楼主有没有好的方法检测pre-miRs,之前尝试过加A法,设计的引物扩增效率不高,然后就改用northern来检测了
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帝王蝶

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发表于 2016.5.20 16:14:09 | 显示全部楼层
各位大神,今天真是收获太多了,收下,谢了
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.5.20 17:04:02 | 显示全部楼层
bestcg 发表于 2016.5.19 20:10
感谢分享,感觉还是加A法方便些,就是kit贵了点。不知道楼主有没有好的方法检测pre-miRs,之前尝试过加A法 ...

pre-mir 可以直接从mirbase 找到序列,它本身就有个颈环,有80来bp,所以你设计引物的话,就上下各取一段就可以的。
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.5.20 17:04:38 | 显示全部楼层
xiaomaguohebjfu 发表于 2016.5.20 16:14
各位大神,今天真是收获太多了,收下,谢了

下次再发点别的,谢谢关注
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帝王蝶

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发表于 2016.5.27 10:51:55 | 显示全部楼层
,多谢了,正愁没有好的miR引物设计软件呢
热热热热热热热热
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中华鲟

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发表于 2016.5.30 09:05:48 | 显示全部楼层
我滴个天呀 好
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钵水母

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发表于 2016.6.6 11:18:39 | 显示全部楼层
问下楼主,有没有用过haigene的产品,效果怎么样
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钵水母

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 楼主| 发表于 2016.6.6 21:11:35 | 显示全部楼层
eason MA 发表于 2016.6.6 11:18
问下楼主,有没有用过haigene的产品,效果怎么样

没有额 用过吉马的
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草履虫

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发表于 2016.6.17 09:29:24 | 显示全部楼层
不管用不用得着,先谢谢楼主了!
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迅猛龙

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发表于 2016.6.17 23:58:53 来自手机 | 显示全部楼层
好好学习了。
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迅猛龙

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发表于 2016.6.23 21:54:56 | 显示全部楼层
谢谢分享
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钵水母

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发表于 2016.7.4 18:58:59 | 显示全部楼层
后期用,谢谢楼主分享!
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钵水母

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发表于 2016.7.4 19:09:31 | 显示全部楼层
http://www.docin.com/p-720311026.html
之前看过一篇相关文章,叫“microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明”
有兴趣的可以看看。但是文章中有个 DNAstar的软件,我在网页上搜了下 不好下载,
不知道楼主用过这个软件吗?
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帝王蝶

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发表于 2016.9.13 18:18:08 | 显示全部楼层
感谢分享
加油啊
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迅猛龙

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发表于 2016.9.13 22:25:00 | 显示全部楼层
受教了
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帝王蝶

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发表于 2016.9.18 09:41:51 | 显示全部楼层
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钵水母

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发表于 2016.10.9 08:29:33 | 显示全部楼层
不做miRNA,虽然看不太懂,还是觉得好牛掰
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