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PCR引物设计的11条黄金法则

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  • TA的每日心情

    2016.5.13 22:32
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    发表于 2016.5.18 23:16:52 | 显示全部楼层 |阅读模式

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    PCR引物设计的11条黄金法则

    1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
    DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

    2.引物长度一般在15~30碱基之间。
    引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

    3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。
    GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

    4.引物3′端要避开密码子的第3位。
    如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

    5.引物3′端不能选择A,最好选择T。
    引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。

    6.碱基要随机分布。
    引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

    7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
    引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
    两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
    引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

    8.引物5′端和中间△G值应该相对较高,而3′端△G值较低。
    △G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高,而3′端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析)

    9.引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。
    引物的5′端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。
    引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

    10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
    某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

    11.引物应具有特异性。
    引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

    附:
    值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。

    做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求:

    1)避免重复碱基,尤其是G.
    2)Tm=58-60度。
    3)GC=30-80%.
    4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
    5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。
    6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80~150bp最为合适(可以延长至300bp)。
    7)引物的退火温度要高,一般要在60度以上;
    要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
    而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
    至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

    做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物,你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

    关于BLAST的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用。

    ps:引物设计的软件很多,不过根据本人设计引物所使用过的软件来讲,我更相信自己手动设计的,利用DNAMAN来设计,尤其是对于要设计QPCR(实时荧光定量)的同学来讲,DNAMAN的自动设计引物功能是最好用的。Primer 5,6设计引物不太好用,很难挑选到一条评分100%的引物,大家可以采用手动,利用DNAMAN软件辅助设计,这只是个人经验,不喜欢勿喷!

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    发表于 2016.5.19 08:28:26 | 显示全部楼层
    感觉是110条,再精简点就好了
    中午好!
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    发表于 2016.5.19 09:29:13 来自手机 | 显示全部楼层
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    发表于 2016.5.19 15:02:15 | 显示全部楼层
    呵呵,这种帖子还是不错的,支持
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    3 天前
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    发表于 2016.5.19 15:49:40 | 显示全部楼层
    "引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。"我再设计引物一般都是设计在60~65℃之间的,这里学长说最好接近72℃,这是为什么呢,相比TM设计在60℃有什么优点?-----这一点不是很懂,请教一下学长
    你好
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    1 小时前
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    发表于 2016.5.19 17:59:21 | 显示全部楼层
    怎么说呢,这些规则应该是guideline,并不一定完全照做。我原来的大老板说的很好,做引物就像找媳妇,最完美的不一定是最合适的。引物好不好,还是要看具体PCR效果的。

    点评

    你们老板说话很通俗、鞭辟入里啊  发表于 2016.5.25 23:07
    这句话……我也是醉了  发表于 2016.5.23 14:37
    新的一天加油!
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    发表于 2016.5.20 16:25:47 | 显示全部楼层
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    发表于 2016.5.22 08:03:37 来自手机 | 显示全部楼层
    说得好
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    发表于 2016.5.25 22:56:58 来自手机 | 显示全部楼层
    之前做克隆设计引物都没那么讲究,不过有这么个法则还是可以参考参考的
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  • TA的每日心情

    2017.2.2 11:18
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    发表于 2016.5.31 14:48:15 | 显示全部楼层
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    发表于 2016.6.17 12:48:44 来自手机 | 显示全部楼层
    学习了。
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    2018.1.30 15:41
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    发表于 2016.7.7 21:41:08 | 显示全部楼层
    对新手来说好吃力,不过还是谢谢。慢慢看就好
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  • TA的每日心情

    2017.1.21 22:32
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    发表于 2016.8.15 16:04:43 | 显示全部楼层
    看看还是很有好处的
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    2016.12.28 16:57
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    对初学者的引路
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    发表于 2016.9.5 20:17:02 | 显示全部楼层
    普通引物设计建议大家用 Oligo7,这是现在最好的引物设计软件。这款软件独有的引物评价功能可以帮我们找到较为理想的引物。
    开学ing
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    {:8_416:}
    gcfc 城管局
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    zhouyulu 发表于 2016.5.19 07:49
    "引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。"我再设计引物一般都是设计在60~65℃之间的,这里学长说最好 ...

    Tm温度越高,特异性越好。一般到不了72度
    很美6666666666666666666666
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    发表于 2017.3.28 16:05:51 | 显示全部楼层
    引物设计软件有primer, oligo, DNAMAN,这些软件在哪些时候最适用呢?miRNA 的引物设计用哪个软件好些呢
    早早早,
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