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[多样性测序] 三代全长16s — 望向微生物世界的尽头

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功夫熊猫

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发表于 2021.10.15 11:38:14 | 显示全部楼层 |阅读模式
一、微生物研究新世代-三代全长16s测序方案

1990年,人们首次发现了环境样本中存在的16s rRNA序列[1],阐述了其研究潜力,自此开启了一个波澜壮阔的微生物群落研究时代。时至今日,群落研究已全面进入测序分析阶段,当前研究主流处于二代扩增子与三代扩增子交接的时段。

每一轮的技术革新都带来了研究思路上的改变,二代扩增子技术带来研究思路关注群落整体多样性变化、侧重门/属等水平微生物构成。三代扩增子技术则更进一步,更加关注不同组学间的关联,不仅关注门/属等水平物种丰度,也能够探索属内物种的协作/竞争关系。

支持三代扩增子往更精细、更全面合纵连横的基础是三代全长16s技术上的高分辨率特征:二代16s因其扩增片段极限长度仅500-600bp,因此对于二代扩增子挑选可变区是个大难题,挑选意味着妥协与信息丢失,反映在文章中则是属、种水平的未鉴定物种比例高企;三代16s则能够轻松覆盖16s总长约1,500bp共9个可变区,最大程度保留了物种鉴定的可能性。

图1 文章中二代16s与三代全长16s未鉴定物种占比结果对比[2]

有了如此高的分辨率表现,菌种级别的研究自然成为了研究重点,不同于过往对于二代16s科、属水平的研究,三代全长16s能够提供更全面且细致的菌株级别分析结果,让整个研究结果更贴近生态学功能,对于多组学关联以及后续课题实验指导、验证都有着巨大意义。从多组学关联的角度来看同样如此,更精细层面数据进行多组学关联往往能够揭示出更清晰的局部规律,这其中就有很多过往被忽略或无法触及的细节。

二、经典多组学关联策略

围绕微生物群落数据的关联已有十分成熟的方案,典型代表有:

1. 三代16s+宏基因组(验证与补充):16s能够对群落物种组成进行描述,宏基因组则能够对16s物种结果进行验证,此外宏基因组还能够给出基因及功能注释结果,对样本群落间差异进行功能层面解析。

2. 三代16s+代谢组(关联与预测):代谢组作为最接近生物学表型的一种组学,将其与16s所获得的物种丰度进行关联,从不同分子层面出发,借助统计模型可以构建起两者间的关系网络,挖掘潜在的核心调控因素。

这两大类主流关联思路从不同角度进行物种为核心的关联分析,而三代16s的加入则能够使关联的主角从模糊的门、科水平分类细化到菌种水平,对于关键物种筛选、后续实验验证指导有着更积极的作用。

我们以一篇经典的三代16s+宏基因组的文献为例,为大家来展开介绍这类关联思路文章的具体应用。

三、经典三代16s多组学文献

慢阻肺疾病呼吸道微生物群落调查[3]
Frontiers in Microbiology IF=5.64,2020

研究背景

慢阻肺(COPD)是一种异质性肺部疾病,此类疾病已有报道会引起呼吸道微生物群落结构产生对应变化,过往此类疾病微生物研究受限于技术手段分辨率,多集中在科、属水平开展,种水平的研究较少,菌种水平研究结果对于后续的疾病防治有重要意义。

实验设计

收集98名不同疾病阶段的COPD患者、27名健康对照者呼吸道分泌物进行三代16s测序,并挑选了10个健康对照与10个患者样本进行宏基因组测序分析。

图2 研究思路图

研究结果


01. 疾病呼吸道微生物群落概况

基于weighted unifrac距离的PCoA结果显示COPD组与对照组群落结构组成具有显著差异(图3 A),在alpha多样性以及物种组成上也同样显示群落结构具有显著差别(图3 B),通过lefse分析,获得11个组间显著差异的biomarker物种(图3 C)。

图3 呼吸道微生物群落概况

02. 呼吸道微生物属内菌种竞争变化

基于三代16s技术能够更加深入分析种水平微生物不同疾病阶段相对丰度变化 。例如:虽然Neisseria属微生物在COPD组中随疾病阶段加深物种相对丰度增加,但该属的若干个种分类水平微生物总体呈丰度下降趋势,仅1种微生物整体呈相对丰度上升趋势(图4)。通过构建同属微生物共发生网络图观察到同属不同物种间的竞争负相关现象,且种间负相关的现象比正相关频率高(图5),这些现象表明疾病现象可能加剧呼吸道属内物种相互竞争排斥,从而使得呼吸道微生态群落结构发生紊乱。

图4 同属内微生物不同疾病阶段物种丰度变化

图5 同属微生物共发生网络图

03. 呼吸道微生物16S各可变区效果评估

针对16s序列9个可变区进行了综合比较,各分类水平物种分辨率、beta多样性距离以及功能丰度结果上看,全长16s(V1V9)对于鉴定呼吸道微生物群落结构相对于目前常见的V3V4、V4等类型扩增子具有全面优势(图6)。

图6 各可变区测序效果评估

04. 呼吸道微生物群落功能分析

宏基因组测序结果以及三代16s的Picrust2软件进行功能结果输出,结果表明“硝酸盐还原”以及“乙酰辅酶A参与生成丁酸”两种功能在疾病组中丰度显著降低(图7D),说明呼吸道微生物的丁酸生成途径受阻与慢阻肺发展存在密切联系。

通过计算相关性发现,整体上三代16s功能预测结果与宏基因组功能分析结果呈高相关性(图7C),说明全长16s的功能预测结果相对于普通类型扩增子结果更加可靠。

图7 功能预测结果

05. 小结


这篇文章从慢阻肺疾病引发的微生态紊乱现象着手,引入三代全长16s技术与宏基因组学进行微生态结构组成与功能调查。借助三代全长16s技术的高分辨率特性挖掘到属内物种相互竞争、整体负相关这一过去未曾被发现的现象,并通过各可变区结果对应证明了三代全长16s技术在呼吸道群落微生物领域的研究潜力。之后,对群落功能以及潜在的慢阻肺微生态调控机制进行分析,借助宏基因组学对群落功能进行了补充与验证。

四、最后

三代全长16s作为新一代群落微生物研究手段有着很强的研究潜力,是未来菌种水平研究的一大必备手段,此外,随着三代测序的价格越来越亲民(基迪奥云商城三代16S测序分析低至300元/样本),“三代全长16S”也顺利晋升为“好方法”,突破传统二代测序“属种”分析的瓶颈,助力更准确更精细的微生物研究。


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▼参考文献▼
[1] David M. Ward, Roland Weller, Mary M. Bateson, 16S rRNA sequences reveal uncultured inhabitants of a well-studied thermal community, FEMS Microbiology Reviews, Volume 6, Issue 2-3, June 1990, Pages 105–115, https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1990.tb04088.x
[2] Matsuo, Y., Komiya, S., Yasumizu, Y. et al. Full-length 16S rRNA gene amplicon analysis of human gut microbiota using MinION™ nanopore sequencing confers species-level resolution. BMC Microbiol 21, 35 (2021). https://doi.org/10.1186/s12866-021-02094-5
[3] Wang Z, Liu H, Wang F, et al. A Refined View of Airway Microbiome in Chronic Obstructive Pulmonary Disease at Species and Strain-Levels. Front Microbiol. 2020;11:1758. Published 2020 Jul 30. doi:10.3389/fmicb.2020.01758


本文作者:;基迪奥-阿拉雷

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