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Smart-seq2单细胞转录组测序 转录调控信息分析利器

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发表于 2021.7.5 11:30:41 | 显示全部楼层 |阅读模式

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单细胞转录组研究的难点在于单个细胞RNA含量极低,低至pg级别,而约80%以上信息为rRNA,无法利用传统RNA扩增技术构建高通量文库。
Smart-seq2是目前最常用的单细胞转录组技术,最低能够以单个细胞或10pgRNA为模板,通过设计Oligo(dT) VN Primer作为逆转录引物,利用逆转录酶的模板转换(Template-switching)活性,在cDNA的3’端添加一段接头序列,通过该接头序列进行后续PCR扩增,可以获得全长cDNA扩增产物,进行基因表达检测、差异分析、可变剪接、融合基因等遗传调控信息分析。

实验建库流程

图1  Smart-seq2单细胞转录组实验流程图


单细胞分离由合作方完成,基迪奥寄送细胞裂解液,经Smart-seq2技术扩增得到双链cDNA,利用Tn5转座酶酶切打断,同时加上接头,经过PCR扩增及磁珠纯化等步骤构建好文库,质检合格后进行高通量测序。

分析内容

图2  Smart-seq2单细胞转录组分析流程图


注:标红色分析为动植物(非人、非大小鼠)特有,标橙色分析为人、大小鼠特有,标绿色分析为所有物种共有;个性分析内容(如细胞聚类、亚群差异表达分析)可根据实际需求选择分析。

部分分析结果



样本和测序要求



案例一  Smart-seq2揭示人CD127+先天淋巴细胞的异质性

先天性淋巴细胞(ILCs)被认为是体内平衡和炎症的重要参与者。研究表明,ILC群体具有可塑性和异质性。
流式分选患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者扁桃体组织中648个ILCs和自然杀伤细胞(NK cells),并进行Smart-seq2测序。细胞聚类为4个亚群:ILC1、ILC2、ILC3、NK,差异分析结果显示共有差异基因的表达量在CD127+ILCs中要明显高于比NK细胞;对ILC3中1,958个免疫基因进一步分析,发现了新的免疫细胞类型CD62L+ ILC3。

案例二 10x scRNA-seq联合Smart-seq2绘制小肠细胞图谱


肠道发挥着很多功能,它依赖于很多特化细胞的特定活性和细胞间的相互作用。其中的一些细胞是众所周知的,但有些细胞至今仍不熟悉。

首先利用10x scRNA-seq分析了从小鼠小肠或肠道类器官中分离的53193个EpCAM+上皮细胞,细胞聚类成15个clusters;利用Smart-seq2分析1522个上皮细胞,验证了10x scRNA-seq的数据,并且每个细胞具有更高的覆盖。聚类分析确定了8个簇,与基于10x的聚类一致,但由于细胞数量较少,肠上皮细胞没有更好地区分开。同时文章分析了每种细胞类型的表达特征,包括验证已知的marker基因和鉴定新的marker基因。

Tips:对单细胞转录组测序感兴趣的老师和同学可留言咨询,基迪奥会为您量身定制专业的个性化实验分析方案。


参考文献:
[1]Björklund ÅK , Forkel M , Picelli S , et al. Theheterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed bysingle-cell RNA sequencing[J]. Nature Immunology, 2016.
[2]Haber A L , Biton M , Rogel N , et al. A single-cellsurvey of the small intestinal epithelium[J]. Nature, 2017.



               

来源: Smart-seq2单细胞转录组测序 转录调控信息分析利器
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