查看: 706|回复: 9

[转录组] 5分+文章中DNA甲基化与转录组数据关联是怎么做的?

[复制链接]

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
214
注册时间
2020.6.16
在线时间
129 小时

发表于 2021.4.2 09:20:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.4.2 09:20 编辑

表观遗传(epigenetics)是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变,而DNA甲基化则是当前研究最深入的表观遗传修饰之一。DNA甲基化是一类十分重要的表观遗传修饰,已经有大量研究报道它与基因组稳定性、基因转录调控、疾病发展有着十分密切的关联。

DNA甲基化对于许多类基因的转录过程都具有十分重要的调控作用。当前发展出一套新颖的组学分析思路,将DNA甲基化数据与基因转录组数据进行关联:

1通过WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing,全基因组亚硫酸氢盐甲基化测序)等测序方案获得基因甲基化修饰位点、目标基因甲基化修饰水平、组间差异甲基化区域相关基因等信息。

2转录组测序(RNA-seq)获得基因的表达量信息。


3采用提取交集的思想获得甲基化修饰水平与基因表达共同上/下调的正向调控基因(或一方上调另一方下调的基因,即负向调控关系),进行对应基因的富集分析,挖掘差异甲基化修饰潜在的功能调控机制。


4配合下游生物学实验(甲基化转移酶敲除/过表达等)进行机制验证。


这种新颖的关联思路将原先孤立的DNA水平与RNA水平数据进行了贯穿分析,让数据能够互相佐证,对于测序数据的利用效率得到了很大程度的提高,对于目标基因筛选更加精确,对于结论的说明更加有力,能有效提升文章的竞争力。

这里我们以一篇经典文章为例,为大家介绍这类关联思路的具体应用:


DNA甲基化影响鸡肉的脂肪沉积机制研究
2020,IF=5.201

研究背景

肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)是影响肉质水平的重要因素,受到遗传、营养以及环境等因素调控。肌内脂肪的沉积主要是脂肪细胞的分化、成熟与增殖结果,涉及到许多代谢途径与相关基因,当前家禽脂肪沉积的表观修饰机制还未得到详尽的研究。

实验设计

采集鸡的肌肉组织分离肌内脂肪中的前脂肪细胞(IMF_Pre)与成熟的脂肪细胞(IMF_Ad),进行全基因组甲基化测序(WGBS),了解前脂肪细胞与成熟脂肪细胞的差异甲基化修饰分布,并结合转录组测序(RNA-seq)数据结果,分析差异甲基化修饰与相关基因表达间的关联与潜在调控关系,为后续生物学实验的验证提供指导。

实验结果

1.脂肪细胞DNA甲基化分布特征

免疫荧光染色等实验结果表明,脂肪细胞成熟过程中5mC类型的DNA甲基化修饰显著降低。WGBS测序结果表明:总体上脂肪细胞DNA甲基化类型大多为CpG类型,占比超过60%,少量占比(约1.2%)甲基化为CHH/CHG类型甲基化(图1)。成熟脂肪细胞(IMF_Ad)与前脂肪细胞的(IMF_Pre)差异甲基化修饰区域(Differentially Methylated Religion,DMR)共7580个,主要位于基因间区(42.9%),其次是内含子(31.25%)、TSS区域(16.9%)等(图2)。

图1 脂肪细胞各类型DNA甲基化占比

图2 组间差异甲基化修饰区域(DMR)分布注释

2.DMG分析

DMG(Differentially Methylated Genes,差异甲基化相关基因),被甲基化修饰的基因区及上下游甲基化水平曲线分析表明,基因区整体被修饰水平高于基因上下游区域,在启动子与终止子区域出现V型曲线,与前人文献报道一致(图3)。为了进一步了解DMR的潜在的功能调控机制,将所有DMR相关基因(DMG)进行GO/KEGG富集分析,结果表明,DMG主要参与骨骼系统育、脂肪酸代谢、局部粘附等功能(图4)。

图3 甲基化相关基因区及上下游5k区域甲基化修饰水平曲线

图4 DMG富集结果

3.转录组-WGBS关联分析

为了探索DMG与IMF沉积之间的关系,整合RNA-seq与WGBS数据,筛选与脂肪细胞成熟相关的候选基因。共发现324个甲基化上调、基因表达下调基因;338个甲基化下调、基因表达上调基因(图5)。采用九象限图深入挖掘两组学关联的具体基因,COL6A1,THBS1,LAMA2等一系列参与胰岛素信号转导、脂肪酸代谢的基因被进一步确定为潜在的IMF沉积候选关键基因(图6)。通过qRT-PCR分析不同IMF沉积阶段的三类候选基因表达,结果表明候选基因COL6A1基因在脂肪细胞分化、IMF沉积过程中表达量逐渐升高,COL6A1表达量与脂肪细胞中甘油三酯水平高度正相关(r=0.84,p=0.03)。

图5 转录组差异基因(DEG)与甲基化差异基因(DMG)Venn图

图6 九象限图

4.生物学实验验证

敲低/过表达候选基因COL6A1,分析候选基因与脂肪细胞增殖、分化之间的关系。结果表明:COL6A1过表达促进脂肪细胞分化和成脂相关基因(PARG,CEBPA,FABP4)的表达,相反,敲低COL6A1则相关基因表达量对应显著下调(图7)。该结果说明说明候选基因COL6A1能够通过促进成脂基因的表达从而促进脂肪细胞的成熟,进而使得肌肉的脂肪沉积速度加快。

图 7 敲除/过表达 COL6A1基因后相关基因表达水平

小结

1.DNA甲基化对于许多生物学功能具有调控作用,在实验设计时可以考虑采用测序手段获得差异表型背后的甲基化修饰差异机制。
2.DNA甲基化能够调控基因转录过程,采用WGBS+转录组的关联方案能够将原先孤立的两类数据结果有机结合,帮助快速筛选目标基因,提高效率。
3.针对组学贯穿获得的目的基因,可以考虑开展敲除、过表达等相应的生物学实验进行验证,从而增加数据结论的说服力。

文末福利

基迪奥生物多年专注于表观遗传修饰领域,为广大客户提供优质的DNA/RNA甲基化测序服务以及转录组测序服务,更有定制化多组学关联分析方案,助力客户发表高分文章。

即日起,在OM商城下单满额,还有开春专属福利:

福利一:专业生信培训班,转录组、微生物、10×生信培训班任你挑选!
福利二:赠送云平台会员,肆意使用100+绘图工具;
福利三:赠送原创书籍


OM商城地址:
www.omicsmart.com

咨询电话:020-84506104
咨询QQ:754540083

参考文献
Zhang M, Li D, Zhai Y, et al. The Landscape of DNA Methylation Associated With the Transcriptomic Network of Intramuscular Adipocytes Generates Insight Into Intramuscular Fat Deposition in Chicken. Front Cell Dev Biol. 2020;8:206. Published 2020 Apr 2. doi:10.3389/fcell.2020.00206


本文作者:基迪奥-阿拉雷         

本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2020.12.17
在线时间
10 小时

发表于 2021.4.2 11:18:50 | 显示全部楼层
哈哈哈哈哈给我冲
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
32 小时

发表于 2021.4.3 16:09:51 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
28 小时

发表于 2021.4.4 10:36:51 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
28 小时

发表于 2021.4.5 11:02:24 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
0
注册时间
2020.2.12
在线时间
42 小时

发表于 2021.4.5 12:18:46 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2021.3.29
在线时间
3 小时

发表于 2021.4.5 18:46:57 | 显示全部楼层
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2020.11.21
在线时间
32 小时

发表于 2021.4.6 09:48:46 | 显示全部楼层
坚持就是胜利!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
3
注册时间
2017.9.8
在线时间
28 小时

发表于 2021.4.7 08:39:16 | 显示全部楼层
加油,加油!
回复

使用道具 举报

草履虫

Rank: 2

主题
0
注册时间
2020.11.11
在线时间
1 小时

发表于 2021.4.7 10:38:27 | 显示全部楼层
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表