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磷酸化蛋白质组学——分析思路

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发表于 2021.3.19 09:21:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.3.19 09:20 编辑

蛋白的磷酸化是生物体内重要的蛋白质修饰类型,会影响到细胞内信号转导、细胞结构、细胞增殖、凋亡、转录、代谢过程以及调控病原微生物的适应能力等等过程,是众多生命过程的关键“开关”。前面我们介绍了磷酸化蛋白组学的研究方法(文章链接:磷酸化蛋白质组学——研究方法),下面就来介绍一下我们拿到磷酸化蛋白质谱定量数据之后常用的分析思路。

基础分析思路

图1 磷酸化蛋白质组基础分析思路

1.磷酸化肽段鉴定及统计

①搜库:通过TMT、LFQ或DIA拿到原始串联质谱图,利用软件进行搜库。

②校正:软件分别识别各样本中肽段母离子的峰面积即肽段的相对丰度,然后采用高性能的保留时间对齐算法对来源于不同样本的相同肽段进行对齐,采用样本的总离子流(TIC)进一步对数据进行归一化处理,样本中各蛋白的丰度由原始丰度除以归一化系数获得。

③筛选:筛选含有至少1条unique肽段,去除掉非磷酸化修饰的肽段,以及不满足阈值范围的磷酸化肽段(如在DIA的Spectronaut分析中,PTMLocalizationProbabilities>0.75为可信度较高的修饰位点)。

④磷酸化肽段统计:因为磷酸化蛋白的分析是从样品中提取蛋白,酶解成肽段,再富集出有磷酸化修饰的肽段,所以在PP的研究中以肽段为单位进行分析更为准确。

⑤磷酸化蛋白统计:如果想了解磷酸化蛋白的功能,就要相应的找到磷酸化肽段来源的蛋白,对各样本中磷酸化修饰的肽段来源蛋白的数量进行统计。

⑥磷酸化位点统计:一个肽段上可能存在多个磷酸化位点,而磷酸化位点会由于非特异性酶切或者漏切导致重复的鉴定和定量,所以在进行位点鉴定数目的统计时,为了保证结果的可靠性,会去冗余合并数据再做位点数目上的统计。此外,由于真核生物中大部分磷酸化来源于丝氨酸(S)、苏氨酸(T)及酪氨酸(Y),会对这三个位点的修饰数量及比列进行统计。

图2 磷酸化肽段鉴定及统计常用图形

2.磷酸化蛋白注释

得到了磷酸化蛋白,通过常用的如GO、KEGG、KOG/COG数据库进行蛋白注释,可以了解这些磷酸化蛋白的功能。

另外,由于磷酸化修饰可通过直接或间接的方式调控转录因子的活化,让细胞以应答各种信号刺激后快速调节自身活性,进而调节下游基因的表达,所以对磷酸化蛋白进行转录因子注释,看看哪些转录因子发生了磷酸化也是常见的分析点之一。还有研究发现磷酸化修饰会影响蛋白亚细胞定位从而让蛋白在不同部位发挥功能,所以还可以进行亚细胞定位分析,看看在磷酸化的影响下,哪些蛋白改变了发挥功能的区域。

3基本差异分析

为了了解实验组相对于对照组磷酸化修饰变化的情况,对鉴定到的磷酸化肽段定量后,利用Student’s t-test等检验方法进行组间差异分析。一般根据差异倍数FC>2,显著性检验p-value<0.05作为阈值,筛选显著变化的磷酸化肽段。针对差异磷酸化肽段来源的磷酸化蛋白再利用GO或者KEGG数据库进行差异富集分析,以寻找差异变化的磷酸化蛋白都影响到了哪些关键的调控通路。

图3 差异磷酸化蛋白分析结果常用图形

4.Motif分析

Motif是蛋白中具有普遍性和生物学意义的氨基酸序列模式。这些motif就像是蛋白质家族的签名,可以通过它们了解和预测蛋白质功能。磷酸化修饰是通过上游激酶去识别特定的motif序列对蛋白进行磷酸化,文章通常对差异磷酸化位点进行motif分析和统计,以通过motif结构信息了解激酶复杂的调控机制。

比如2019年在《Plant&Cell Physiology》杂志上发表的用PP揭示ABA(脱落酸)信号在大麦胚胎成熟后衰退的文章[1]。作者对FH(新收获)和AR(成熟的大麦籽粒)用ABA进行处理,对表达上调的329个磷酸化肽段包括334个磷酸化位点的motif进行统计,发现三类保守motif,[-pS-P-]、[-R-x-x-pS-]和[-pS-F-];对发生下调的235个磷酸化肽段包括242个磷酸化位点进行统计,发现[-pS-P-]、[-R-x-x-pS-]保守motif,其中[-R-x-x-pS-]都有富集到,可受到SnRK2s激酶调控,并通过体外实验验证了结果。

图4 大麦胚胎中磷酸化肽段的motif分析

5.KSEA分析

激酶-底物富集分析(Kinase-Substrate Enrichment Analysis,KSEA)根据差异磷酸化肽段及其磷酸化修饰位点,分析其上游可能存在的调控激酶,并对激酶进行打分。可用于推断细胞通路以及探究信号级联反应在药物治疗和疾病中的变化。

KSEA分析结果如图5。图中每一行就代表了一个激酶,每一个激酶都有一个score,计算公式:
表示特定激酶对应的已知磷酸化底物log2(FC)的平均值;
表示数据集中所有磷酸化位点log2(FC)的平均值;
表示实验中特定激酶磷酸化底物数量;
表示数据集中所有磷酸化位点的log2(FC)的标准差。

根据公式就可以看出来,KSEA不是根据一个底物去判断激酶活性,而是根据总的底物数量及丰度去评判。下图中有颜色的激酶代表磷酸化水平有变化的激酶,红色代表实验组相对于对照组发生上调,蓝色代表下调,分数越高代表激酶活性越高。有了这个结果,再对应回通路去看,就知道哪个通路中,哪个激酶在实验组处理之后,发挥了重要的作用。比如图5这个结果,来自2020年发表在《Cell》上用PP研究肺腺癌(LUAD)分子机制的文章[2]。文章将鉴定到的磷酸化蛋白分为三种亚型,环境和新陈代谢相关S-Ⅰ,混合型S-Ⅱ,增殖和蛋白酶体S-Ⅲ,利用KSEA分别根据差异磷酸化结果去找有代表性的激酶,结果发现AKT1与S-Ⅰ相关,PRKCE与S-Ⅱ相关,AURKB、PRKCA、MAPK14与S-Ⅲ型最相关。通过这种方式进一步确定多种蛋白质可能受到了与癌症相关的磷酸化信号调节。

图5 肿瘤中三种蛋白亚型KSEA活性分析结果

6.磷酸化蛋白互作网络分析

已有研究发现磷酸化修饰会影响蛋白之间的相互作用,通过PPI网络也能了解到起到关键调控作用的磷酸化蛋白或激酶。比如图6中是来自《Cancer Research》研究治疗去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的小分子激活剂蛋白质磷酸酶的一篇文章[3],文章发现用PP2A(小分子激活剂,SMAP)处理CRPC细胞,可降低细胞活力和克隆原性,诱导细胞凋亡。文章利用人类蛋白数据库进行PPI网络分析,613个磷酸化蛋白存在982对互作关系,从其中挑出了degree连通性最高的hub proteins绘制了更精细的子网络图。结果发现AR蛋白(雄激素受体)是连通性最高的蛋白,而这个蛋白在SMAP处理下发生显著下调,所以推测化合物的活性破坏了AR相关的通路。

图6 蓝色代表去磷酸化蛋白,红色代表过磷酸化处理后蛋白,圆圈越大,蛋白的连通性越高

磷酸化蛋白多组学分析思路

1.磷酸化蛋白+全蛋白组学研究思路

如果直接进行组间磷酸化蛋白丰度差异的比较,这种差异的变化无法准确判断是来自蛋白本身,还是来自于磷酸化水平的变化,所以现在推荐对相同样本同时进行磷酸化蛋白和全蛋白组学的定量分析。对于两个组学的数据,文章中有通常两种关联方式:

①用全蛋白质丰度校正磷酸化肽段丰度,即用磷酸化肽段的丰度除以对应蛋白质的丰度,再进行差异磷酸化的分析,对二者均鉴定的差异蛋白数量进行统计,找出重叠的蛋白;

②二者分别做差异分析,用中位数分别校正丰度,再将整体的差异倍数进行比较,差异倍数更大的才是丰度变化的主因。

统计这些差异蛋白富集结果,进一步分析这些蛋白的磷酸化的变化影响了哪些分子通路的改变,进而分析在实验处理下,分子机制的改变。

图7 磷酸化蛋白+全蛋白组学分析思路

2.磷酸化蛋白+全蛋白组+转录组学研究思路

如果我们同时做了磷酸化蛋白和全蛋白组学,还想加上基因层面上的分析结果,可以考虑对相同样本再做最容易入门和挖掘数据的转录组学的分析。在分析内容上,我们可以在上面两组学分析的基础上:

①统计各样品中转录本的数目,找到差异基因;
②将转录组的数据和全蛋白质组数据进行相关性分析;
③统计三个组学的差异结果,找到共有的差异基因和共有的差异通路;
④对三个组学共有的转录因子进行注释,分析一些重要类别的基因,都在哪一个层面上发生了变化。

图8 磷酸化蛋白+全蛋白组+转录组学分析思路

以上是磷酸化蛋白组学单组学分析常用的分析点,以及结合最常见的多组学分析技术全蛋白组和转录组学的分析思路,对相关研究感兴趣的小伙伴抓紧咨询基迪奥销售送样了!下一期推文将分享具体的单组学、两组学和三组学的磷酸化蛋白高分案例,敬请期待!

参考文献
[1]Ishikawa S, Barrero J M, Takahashi F, et al. Comparative phosphoproteomic analysis reveals a decay of ABA signaling in barley embryos during after-ripening[J]. Plant and Cell Physiology, 2019, 60(12): 2758-2768.
[2]Xu J Y, Zhang C, Wang X, et al. Integrative proteomic characterization of human lung adenocarcinoma[J]. Cell, 2020, 182(1): 245-261. e17.[3]McClinch K, Avelar R A, Callejas D, et al. Small-molecule activators of protein phosphatase 2A for the treatment of castration-resistant prostate cancer[J]. Cancer research, 2018, 78(8): 2065-2080.


本文作者:基迪奥-萌神      

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