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[转录组] 转录组进阶之m6A甲基化关联分析

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迅猛龙

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发表于 2021.3.12 09:19:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 基迪奥-Jt桃 于 2021.3.12 09:19 编辑

转录组无疑是当前最“亲民”的组学,大型课题用转录组前期筛选研究目标,中、小课题采用转录组挖掘核心数据。在这个测序普及时期,进行转录组的升级进阶,才能让自己的实验设计从一众单调的转录组方案中脱颖而出。

如果将基因表达过程比作盖房子,那一楼就是DNA,二楼则是RNA,顶楼则是实现各类生物功能的蛋白质。RNA是基因从DNA到蛋白的承上启下者,对于基因表达具有重要意义,因此研究mRNA差异表达的RNA-seq技术广受追捧。

需要关注到的是,基因表达并非一帆风顺,想要从一楼到顶楼,还取决于楼梯的状况(表观修饰,如RNA甲基化)。楼梯闸门被锁死则无法到达顶层(甲基化修饰抑制基因表达),楼梯改造为电梯则到达顶楼更容易(甲基化修饰促进基因表达)。因此对于一项围绕编码RNA的研究课题,可以将视野放在全局水平,不仅研究不同条件下RNA的差异表达,还可以关注差异表观修饰对于基因表达的影响,从而做到转录组的全面进阶。

m6A是当前知名度最高的RNA甲基化类型,自MeRIP-seq(Methylated RNA Immunoprecipitation Sequencing,甲基化RNA免疫沉淀)技术问世以来, 各类有关m6A修饰的RNA高分研究文章频繁见刊,采取RNA-seq与MeRIP-seq两种技术关联分析策略更是成为5分+期刊文章的常客。

近年发表的m6A与转录组关联的高分文章有两大热门研究思路:

1.

前期研究筛选获得目标基因,MeRIP-seq、RNA-seq进行mRNA的m6A甲基化检测,对比不同条件下目标基因m6A修饰的表达差异,敲除/过表达甲基化形成的相关酶(如甲基化转移酶METTL3、去甲基化酶ALKBH5等),进一步验证分析缺失/过表达m6A甲基化对目标基因的表达量变化的调控。

图1 研究思路示意

2.

差异表型样本进行MeRIP-seq测序,获得差异m6A修饰相关基因集,RNA-seq验证相关基因表达。在RNA-seq结果中挖掘m6A甲基化reader蛋白(如YTHDF3蛋白等)组间表达差异,分析reader蛋白对甲基化修饰及基因的表达调控(如reader蛋白读取m6A修饰从而介导RNA降解,抑制基因表达)。

图2 研究思路示意

以一篇今年发表的高分文章为例,为大家介绍此类转录组与m6A的关联分析:

m6A 甲基化调控子宫内膜癌发展进程研究
(Theranostics,IF=8.06,2021)[1]



研究背景

m6A甲基化是真核生物mRNA最普遍的表观修饰,参与肿瘤增殖等生物学过程调控,IGF2BP1蛋白被报道具有识别mRNA中m6A甲基化位点的能力进而调节mRNA参与的代谢通路,目前尚未明确IGF2BP1靶向识别哪些基因的m6A位点以及在子宫内膜癌(Endometrial Cancer , EC)中发挥的作用。

实验设计

采集不同阶段EC患者子宫内膜样本共计96个以及20个正常对照样本进行qPCR、IHC等实验验证IGF2BP1蛋白在EC组织表达。子宫内膜癌细胞系(HEC-1-A、AN3CA等)提取RNA并对应设置去甲基化酶ALKBH5敲除组,进行MeRIP、RNA-seq等测序分析基因m6A甲基化调控机理。

研究结果

EC组织qPCR、IHC结果表明IGF2BP1在EC组织中表达显著上调(图3),上调EC细胞系中的IGF2BP1蛋白表达后EC细胞增殖速率增加,结果暗示IGF2BP1蛋白正向调控EC的发展进程。

图3 正常细胞与EC细胞中的IGF2BP1表达量

敲除去甲基化酶ALKBH5后进行Me-RIP测序,结果表明存在3804基因存在上调的甲基化peak,这些peak普遍存在于终止密码子附近(图4A),motif分析富集到了DRACH这类常见的motif(图4A),说明ALKBH5敲除后甲基化位点得到了大量的保留。IGF2BP1是一类能够识别m6A修饰位点的RNA结合蛋白,敲除ALKBH5后的细胞系分别进行RNA-seq以及IGF2BP1蛋白RIP-seq,将MeRIP上调peak相关基因与转录组上调基因以及RIP上调peak相关基因取交集,获得12个候选目标基因(图4B),对候选基因逐一进行WB等分子实验验证,最终锁定目标基因PEG10。

图4 Me-RIP测序结果展示、靶基因筛选

PEG10能够加速EC细胞增殖,在敲低IGF2BP1基因后,靶基因PEG10的稳定性出现显著下降,EC细胞的增殖得到了抑制(图5)。以上结果表明:EC细胞中,IGF2BP1能够识别靶基因PEG10终止密码子附近的m6A甲基化位点,进而调控EC细胞增殖过程。

图5 两种EC细胞系敲低IGF2BP1后PEG10稳定性对比

小结

RNA-seq与MeRIP-seq关联策略从全局出发,研究m6A甲基化对基因表达的调控作用,  能够有效提升编码基因研究的深度,提高文章的竞争力。

对于m6A甲基化,可以采用RNA-seq测序关注其上游甲基化转移酶/去甲基化酶的表达变化,配合敲除/过表达等方式,改变mRNA甲基化状态,分析甲基化对mRNA表达的调控。

参考文献
[1]Zhang L, Wan Y, Zhang Z, et al. IGF2BP1 overexpression stabilizes PEG10 mRNA in an m6A-dependent manner and promotes endometrial cancer progression. Theranostics. 2021;11(3):1100-1114. Published 2021 Jan 1. doi:10.7150/thno.49345

本文作者:基迪奥-阿拉雷        

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666 可以可以 非常可以
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迅猛龙

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