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发表于 2020.5.25 11:23:42 | 显示全部楼层 |阅读模式
发表期刊:2020  Gut microbes  IF=7.82
合作单位:南京医科大学
关键词:自闭症 肠道微生物 16S 宏基因组 代谢组 随机森林 网络图

研究背景

自闭症谱系障碍是儿童精神类疾病中最为严重的一种,其中胃肠功能失调(便秘)是伴随产生的最普遍的核心症状。因此,研究探讨自闭症与肠道微生物的关联,为自闭症可能的微生物诊疗方案提供参考。

实验方法

1)前期16S初探:143位自闭症儿童(ASD)和143位同年龄的典型发育儿童(TD),粪便样本16S V4区测序。
2)宏基因组深入:从286位个体中挑选30位有便秘症状的儿童(C-ASD)和30位同年龄、性别的典型发育儿童(TD),粪便样本宏基因组测序。
3)代谢物表型关联:C-ASD与TD粪便样本,LC/MS代谢组分析。

研究思路

图1  研究思路

研究结果

1.“大样本量”的微生物特征整体分析-16S

作者首先基于16S进行大样本量的微生物特征初步分析。在物种多样性层面,TD组有173个特有的OTU,ASD组有67个特有OTU。在菌群结构层面,基于OTU水平的Bray-curtis距离(图2)、(un)weighted UniFrac距离的PcoA分析都表明,TD和ASD的菌群结构有显著差异,并且ASD组内的菌群结构差异更大(点分布更为离散)。

在物种层面,研究同时开展了Lefse分析、网络图分析、随机森林分析,以深入探讨两组样本的具体物种特征。

Lefse分析

按大于3.5的阈值(常规阈值设定是大于2,本研究根据预期展示的需要,避免图形过于冗余,提高了阈值),Lefse分析发现,门水平,ASD组变形菌门和放线菌门的丰度显著增加,拟杆菌门显著降低;属水平,ASD组小类杆菌属、希氏大肠杆菌属、双歧杆菌丰度显著增加,而普氏菌属9、巨单胞菌属, 瘤胃球菌属2丰度显著降低。

图2 OTU的Bray距离PCoA散点图

Spearman物种间网络图分析

微生物间有着非常复杂的关系网络,为进一步分析两组微生物特征,研究对比了各组肠道微生物间的网络特征(对比组内的物种网络,比较新颖的物种分析策略,值得借鉴参考)。由于属通常是最接近生态学功能特征的物种分类水平,并且研究在属水平也观察到了有意义特征(Lefse分析结果),故基于属水平分析,筛选各分组内至少在10个样本中存在的物种,计算组内两两物种间的spearman相关系数,按相关性≥0.25且显著性<0.05为阈值,筛选满足的关系对绘制物种间网络图。

如图3,节点表示物种,颜色表示门水平的注释,红线和绿线分别表示正相关和负相关。结果表明,两组的网络关系都主要存在于Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、 Actinobacteria、Fusobacteria的5个门中。但是,TD组物种间的正相关作用更强(红线居多),而ASD组网络更为复杂。

具体来说,两组共有的关系对数量是67,TD特有的361,ASD特有的689;基于连通性计算每个共有节点的中心性(centrality),结果表明物种在两组的节点中心性差异较大。综合分析表明TD与ASD物种关系不同,暗示肠道微生物失调与ASD的密切关联。

图3 各组内属水平物种相关性网络图

随机森林分析


为提供疾病诊断的参考,获得ASD的潜在指示物种,研究基于在95%以上样本中存在的属水平物种,进行了随机森林分析(图4),图中横轴表示mean decrease accuracy,数值越大表示物种的指示作用更强,最终获得24个指示物种,柱子颜色表示物种在那个分组中丰度更高。

图4 属水平水随机森林分析

2.“小样本量”的微生物特征深入分析-宏基因组


在16S水平主要是大范围的门、属的物种分析,结果暗示了非常强的物种与疾病的关联。因此研究基于宏基因组,开展小范围内更深入的分析,因此是基于更精细的种水平和物种基因功能进行探究。

为了使小范围的疾病样本分析更具有代表性,研究筛选了特征性更强的(即已经具有便秘症状)的自闭症儿童(C-ASD)进行宏基因组分析。当然,大家也可以使用microPITA软件从16S样本中挑选最具有代表性的样本进行宏基因组分析。

物种分析

在种水平,PCoA分析表明该水平的物种结构有显著差异。TD组和C-ASD组分别鉴定获得237,828、214,357个特有物种。Wilcoxon秩和检验鉴定出138个显著差异物种,基于种水平物种网络图(构建方法与上文属水平一致),使用Netshift算法鉴定C-ASD的“驱动”物种,即在物种网络由健康到疾病的转化过程中,有重要驱动影响作用的物种。

敲黑板:挑选指示物种最常用的判断方法是直接基于物种丰度的变化,如统计检验、Lefse、随机森林等,而基于物种关系的变化来判断也有重要应用价值哦。Netshift的核心思想是基于两组网络共有的、新增的关系对,构建一个评分体系,即评估每个节点的重要性得分,进而筛选出核心物种。

如图5,点表示物种,绿线和蓝线分别表示TD组和C-ASD组特有的关系对,红线表示两分组共有的关系对。红色点表示鉴定的“drivers”,即Ruminococcus lactaris。

图5 Netshift指示物种分析

功能分析


由健康到疾病的物种变化特征暗示物种参与发挥了重要作用,而功能分析则可以进一步解释具体是什么样的作用。宏基因组分析共鉴定获得1,550,192个unigene。基于KO(KEGG level D层级)的ANOSIM分析表明,TD与C-ASD的基因组成存在显著差异;基于pathway(KEGG level C层级)的PCoA分析表明分组的代谢通路组成也存在显著差异。KO和pathway的Wilcoxon秩和检验和Lefse分析(图6)均鉴定到了大量的显著差功能。同时研究还基于eggNOG、CAZy、ARDB 3个数据库开展功能对比分析,结果都表明了C-ASD的功能差异,暗示肠道菌群功能失调严重。

图6 功能差异Lefse分析

3. 粪便代谢组分析

已经有越来越多的证据表明肠道微生物的代谢物可以通过血液循环等途径影响宿主功能特征,而且代谢物是最接近表型的组学,因而研究进一步开展了粪便代谢组分析,揭示TD与C-ASD的代谢特征。OPLS-DA(图7)表明两组代谢物丰度分布有显著差异,wilcoxon秩和检验鉴定获得17个显著差异代谢通路。有37个代谢物丰度变化超过2倍。

图7 代谢组OPLS-DA分析

4. 物种与代谢物关联分析

为进一步阐明肠道微生物与ASD的密切关联,研究开展了物种与代谢物的关联分析。基于高丰度的top45个种和显著差异的代谢物,计算spearman相关系数(图8),结果表明Ruminococcus lactaris、Alistipes spp.、Oscillibacter sp. ER4、Faecalibacterium sp.CAG:74与dihydrojasmonic acid、butanone、hexanoic acid、flunitrazepam、fospropofol、 caprolactone存在显著正相关。

一方面Ruminococcus lactaris也是上文分析鉴定的疾病驱动物种,另一方面这些显著正相关的代谢物是神经递质代谢通路上的重要中间化合物。由此可以看出,肠道微生物不仅在TD和ASD存在较大的组间差异,而且确实与神经系统有关的代谢物关联,充分证明了肠道微生物在ASD患者发挥的重要作用,为后续诊断治疗提供了重要参考价值。

图8 物种与代谢物关联分析

小结

1)研究思路清晰完善,将微生物与ASD的关联解析逐级深入,娓娓道来。首先是大样本量16S在门和属水平的初步探讨,然后是小样本量宏基因组在种和功能水平深入分析,最后是代谢水平表型特征讨论,并通过宏基因组与表型的关联分析进一步验证深化。研究思路与组学应用策略值得借鉴。

2)分析点丰富,16S、宏基因、代谢,每一个分析点都离不开分组差异的讨论。但文章不是简单分析点的重复,针对每个组学都加入了特色的分析方法。如16S是Lefse、随机森林、网络图;宏基因组是统计检验、Lefse、Netshift;代谢物是OPLS和统计检验;物种与代谢是相关性热图。

文章中高级的随机森林、网络图、显著性标记的热图等一系列分析和可视化,Omicsmart平台都可以实现哦。

由这篇文章可以发现,结合16S、代谢组等多组学的应用是提升宏基因组研究档次的重要宝典,但是除了多组学,加入binning等高级分析也可以大大提升文章的研究深度。对宏基因组和binning分析感兴趣的小伙伴,扫描下方二维码,即可预约“所有样本宏基因组binning分析免费做”。

PS:有宏基因组测序计划的小伙伴们抓住机会哦,名额有限,先到先得!

活动最终解释权归基迪奥生物所有


参考文献
Zhou Dan, Xuhua Mao, Qisha Liu, Mengchen Guo, Yaoyao Zhuang, Zhi Liu, Kun Chen, Junyu Chen, Rui Xu, Junming Tang, Lianhong Qin, Bing Gu, Kangjian Liu, Chuan Su, Faming Zhang, Yankai Xia, Zhibin Hu & Xingyin Liu (2020): Altered gut microbial profile isassociated with abnormal metabolism activity of Autism Spectrum Disorder, Gut Microbes, DOI: 10.1080/19490976.2020.1747329


本文作者:基迪奥-小鱼儿


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这么优秀的范文必须好好学习呀
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学习学习~
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基迪奥做出来的图片都很漂亮,但是有的还需要奥比,充钱又很贵
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