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单细胞ATAC和空间转录组的原理原来是这样

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    发表于 2020.5.7 09:40:24 | 显示全部楼层 |阅读模式
    上周的文章《聊一聊10X genomics的技术发展史》中我们了解了从2015年到2018年10X genomics的技术发展历程。不过2018年,还有一项新技术——10X ATAC-seq推出以来备受关注。在2019下半年,10X gemomics推出的空间转录组更是成为新的技术爆点。

    基迪奥生物是国内第一批推出相关服务的科技服务公司,已经在这两项产品上开发出了完备的实验方案和生物信息分析流程。关注这两个新技术,想尽快抢占学术制高点的老师,也可以联系我们。

    下面我们一起来了解一下这两个技术。

    2018 单细胞ATAC-seq

    技术原理

    转录组测序,无疑是分子生物学研究领域大家最熟悉、使用最多的组学技术之一。转录组测序可以为我们全面地提供样本内基因转录表达量的信息。通过常用的分析方法(例如表达差异分析、功能分析等),我们可以快速知晓样本间的转录差异的总体规律(例如,样本间的差异主要涉及哪些通路,发生在细胞的哪些位置)。

    但转录组测序的不足也是显而易见的。因为转录组测序结果本身就是一张表格,我们并无法直接获知基因间错综复杂的调控关系。比如说,我们想了解样本中表达差异变化的基因主要由哪些转录组因子驱动?这些转录因子都潜在结合于哪些启动子或者增强子区,对哪些基因产生了调控作用? 这些问题是转录组测序所没有告诉我们的。ATAC-seq可以帮助我们解开这个答案。

    关于基因组开放性以及ATAC-seq研究背景知识,在基迪奥的出版书籍《基因表达调控——新组学技术介绍与应用》中已经有详细介绍,这里就不再重复讲述。

    10X ATAC-seq可以简单理解为10X DNA-seq的改进版。DNA-seq(全基因组测序)是对样本全基因组的DNA进行获取和测序。而ATAC-seq的目标是获取基因组中保持开放的常染色质区,并只对开放区进行测序。因为只有开放的DNA区域才是潜在被转录因子调控的,我们可以从这些区域寻找转录因子的结合位点,然后推测潜在哪些转录因子可以结合并调控这些区域。

    在富集DNA开放区获取上,10X ATAC-seq和常规ATAC-seq类似,同样采用转座酶去处理基因组DNA。转座酶只能结合于基因组中开放的区域,并将这些区域切断。然后通过富集被酶切碎片化的DNA片段,就可以获得样本中的开放区序列。

    与常规10X转录组或者DNA-seq不同的地方是, 10X ATAC-seq必须破裂细胞构建细胞核悬液(而非完整细胞的悬液),然后再在细胞核悬液中加入转座酶酶切细胞核中的基因组DNA。后续的操作步骤与10X单细胞转录组基本相似:被处理后的细胞核悬液,再导入10X genomics单细胞分离富集的仪器中,完成扩增、建库、测序。

    图1 10X genomics ATAC-seq简要原理示意图

    应用价值

    从以上的10X免疫组库和10X细胞表面蛋白检测,我们可以看到加入新增组学的意义就是可以与10X转录组进行贯穿分析,从不同的维度对转录组数据进行更深程度的解析。例如,10X 免疫组可以更深入解析单细胞转录组中T细胞或者B细胞的信息。10X表面蛋白检测则可以辅助对细胞进行更精确的分类。

    对于10X ATAC-seq其主要价值就是可以和10X转录组数据进行整合,回答各个细胞亚群的分化,亚群间转录组的差异,是由哪些转录因子调控哪些基因的开放区导致的(图2)。很显然,这可以有助于我们从海量的表达差异信息中快速锁定核心的上游调控因子。

    图2 10X ATAC-seq可以帮助我们理清导致转录组变化的上游核心调控因子

    2019 空间转录组测序(Spatial Transcriptome sequencing)

    技术原理

    空间转录组,正如其名,是以分析样本内部不同空间位置转录组信息为目的的技术,与普通转录组和单细胞转录组相比进一步提高了样本内部分辨率。10X RNA-seq虽然将转录组精度提高了细胞水平,但在制作单细胞悬液的时候,每个细胞也丢失了空间信息。即这些细胞来自组织的哪个位置,组织不同位置的基因表达特性如何,这些信息是10X RNA-seq无法告诉我们的。而空间转录组则很好补充了10X RNA-seq的不足。空间转录组的基本原理如下图。

    对于我们关注的组织,我们可以将组织制作为冰冻切片(可以理解为将三维的组织转化为大量二维的切片)。然后选择自己感兴趣的切片转移到空间转录组的组织透化芯片上(大小为6.5*6.5mm)。组织透化芯片大概有5000个小孔(直径约55um),组织切片被透化后,组织各个区域的mRNA就被释放到芯片上的各个小孔中。对各个小孔中的mRNA开展转录组测序,就可以有效检测组织各个区域的转录组信息。简单理解,空间转录组技术可以高效地将一份切片区分为5000个小区域,然后用于平行开展5000次转录组测序。

    图3 空间转录组的基本原理示意图

    空间转录组与10X RNA-seq相比,有相似也有不同。相似之处是检测通量,两种技术都是高通量平行进行大量转录组检测的技术。不同之处有两点:
    1)是否可以保留转录组对应的空间信息;
    2)单个转录组的构成。

    值得注意的是,空间转录组的最小单位并不一定是单个细胞。芯片上的孔径是55um,里面会落入若干个细胞的mRNA,且大概率不同细胞的混合物。所以,空间转录组并不能和单细胞测序等同。但是通过一些算法,我们推算空间转录组每个区域的细胞构成(当然,前提需要有单细胞转录组数据)。这些详细的原理,我们将在后续空间转录组专门的章节进行介绍。

    表1 10X RNA-seq与空间转录组的比较

    看到这里,你可能会觉得空间转录组和10X genomics公司其他产品虽然有相似,但风格差异还是很大。空间转录组技术对应的商业化公司Spatial Transcriptomics实际上是一家瑞典公司。这个技术在瑞典人手里一直不温不火(虽然发的文章因子很高)。2018年底10X Genomics宣布收购Spatial Transcriptomics,并在2019年底正式推出10X genomics优化整合后的空间转录组产品。相比旧的空间转录组产品,新推出的产品增加了透化芯片上的小孔数量(5000个),从而提高了空间检测的精度,并增加了相关配套软件。

    空间转录组技术与单细胞细胞转录组技术可以良好互补,结合10X genomics公司的影响力,空间转录组技术目前大热,估计将会成为接下来几年的研究热点之一。

    应用价值

    (1)转录组信息更好与组织形态的特征关联

    我们研究的组织,在形态水平其实有大量信息。例如,癌组织的病理切片中不同位置的病例特征差异很大。在某种植物的一小支花芽上也有丰富的结构信息。但传统的转录组测序,只能将较大的组织混合在一起进行转录组检测,我们最终得到的转录信息只是整体组织基因表达信息的总和。因此,仅仅基于常规转录组技术,我们无法将自己观察到组织形态特征与转录组信息进行关联。

    能起到类似效果的技术应该是组织原位杂交或免疫荧光技术。但这类分子生物学技术通量非常低,一次只能检测少量基因。这要求我们有明确的目标基因才可以开展实验,且获得基因信息太少而无法进行组学水平的系统分析。

    空间转录组技术可以理解为是一种高通量的免疫荧光技术,一次可以帮助我们检测成千上万个基因在精微组织中的表达信息,从而实现转录组信息和组织形态特征的关联。

    (2)可以与10X RNA-seq技术互补

    上文提到,两类技术相似又不同,从而可以进行互补获得更多信息。基于单细胞转录组的信息,我们可以从空间转录组数据推算组织各个区域的细胞构成,那么我们可以信息就可以兼顾空间水平的精度(组织每个位置的基因表达信息)和细胞水平的精度(组织每个区域的细胞种类构成,以及各类细胞的基因表达特性)。

    今天的文章分享就到这里。随着科技进步,单细胞测序的技术和应用也在不断向前迈进,我们也期待未来有更便捷、更有针对性的测序技术出现。



    本文作者:基迪奥-周煌凯

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