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[转录组] 组学乐高——空间转录组难点剖析

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  • TA的每日心情

    2020.6.3 17:02
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    发表于 2020.1.9 10:09:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
    ​在之前的微信文章《组学研究中的乐高——空间转录组》中,我们对空间转录组的原理及流程进行了介绍,相信大家对于什么是空间转录组已经有了一定的认知。

    在上篇文章中,我们将空间转录组学比作组学研究中的乐高,不仅仅是因为这项技术可以像搭积木一样,把组织中得到的一个个点的转录本信息“拼”回组织中,也因为空间转录组的自由度、可创造性和数据还原度都很高。

    初玩乐高时,大部分人都会觉得很简单,不过是几十块零件的拼搭;但是随着接触越来越深,零件由几十个增加到了上万个,从图纸教程到自己设计,这个游戏也就变得复杂了起来。

    空间转录组看似很简单,组织切片加上组学测序就是整套实验流程,后续分析只是各个区域的基因表达。空间转录组的自由度和数据还原度是它的特点和优势,但同样也为整个组学技术增添了未知的难度。今天,我们就来一起了解一下“乐高”难在哪。

    总体而言,空间转录组的自由度带来的是高度的个性化,而个性化越高需要考虑的因素就越高,实验难度就越大。


    图1 空间转录组个性化程度

    1、样品准备

    样品准备是整个技术的起始,其难点就在于冷冻切片。空间转录组的芯片单点直径是55μm,并没有达到真正的单细胞级,单点捕获的真实细胞数量是由切片厚度、切片平整度、切片完整度和细胞直径共同决定的。所以,如何调整最合适的切片条件是实验开始的重点:

    ①直观而言,不同组织的细胞大小是不一样的。在普通组织切片中,我们可以追求极致的单层细胞而选择2-3μm的切片厚度。但是在空间转录组,2-3μm意味着一层破碎的细胞,是不适合进行下游实验的。所以,切片的厚度也应随着细胞大小而做出个性化优化。

    ②不同组织的脂质、蛋白质含量是不一样的,导致在相同的冷冻温度下其硬度和延展性也存在差异。对于一块组织来说,温度过低,组织脆性会增加,获得的切片会有或大或小的裂隙;温度过高,组织延展性会降低,切片容易出现褶皱。所以,切片环境温度会成为组织相关的个性化点。

    2、组织染色

    10x Genomics提供的protocol详细讲解了HE染色的步骤,并对伊红溶液的浓度和配方做出了优化。我们不得不承认,HE染色是现在广泛用于组织学研究的染色方法,但HE不能适应所有的研究环境。例如PAS(高碘酸希夫氏染色)染色对肾小球和皮肤基底膜的呈现明显优于HE,Masson染色对组织纤维化的呈现效果也是优于HE的。

    2017年和2018年两篇植物空间转录组的文献使用了甲苯胺蓝染色法以适应植物组织[1][2],这告诉我们,HE染色并非唯一适用于空间转录组的组织学呈现方法。所以,针对特殊的研究需求,老师是可以提出优化的染色方案的。

    图2 不同染色方式效果图

    3、实验设计

    我们说过,空间转录组是一项自由度极高的技术,其自由度大半体现在实验设计上。普通转录组的实验设计已经趋向同质化,不同处理组、不同处理时间组是大部分普通转录组文章都会使用到的实验设计;但是空间转录组因为它的空间特性,将实验设计的复杂性带入了样本内部:

    ①样本大小往往超过芯片要求的6.5*6.5mm,如何选择切面、修剪组织成为实验设计的重要组成部分。对于一块组织而言,其内部的复杂程度是远超样本间关系的,例如组织内的解剖区域、特有细胞的分布情况等都是在实验设计时需要考虑的内容。如何合理安排样本切割和切面暴露关乎数据分析的有效性。

    ②样本内部的空间信息为实验设计增加了纵深。空间转录组的出现就是因为组织空间异质性的存在;换句话说,无论连续切片上的相邻点还是同一个解剖区域的点阵都可能存在差异。那么,在实验设计时是否选择连续切片、切片距离间隔、单样本使用切片数等因素影响了实验设计的数据深度。

    图3 空间转录组的空间重构效果

    4、数据分析

    数据分析一直是各个组学个性化最高的一个部分。在空间转录组中,因为实验设计的复杂性和空间异质性的存在,其数据分析难度也提升了很多:

    ①数据分析个性化强。从空间转录组的发文情况可以看到,具备个性化数据分析思路的文章多刊登在顶级期刊上,而套用现有思路的文章多为10-20分的文章,而这也是新技术的普遍发文现象。不过,从其中也可以看出来要有一套深度的个性化数据分析的难度确实不低。

    空间转录组文章发表列表

    ②空间参数在数据分析中的合理应用。空间转录组的数据与其他转录组数据不一样的地方就是每一个spot的转录组数据在组织中是有固定空间位置的,这为数据带来的新变量就是空间参数。

    在数据较少时,spot还不能构成广域的空间结构,此时空间参数对整个数据分析的影响还不会太大,将spot视作单细胞的分析流程也不会有太大问题;但是伴随着实验数据的增多,空间参数将不可忽视,那么这两个软件的聚类方法是否还适用将无法确定。所以,空间参数在数据分析中的应用是一个难点。

    ③潜在的巨大内存消耗。时空序列分析一直是研究热点,以其中使用最普遍的模型为例,LSTM模型消耗的内存量是与矩阵大小呈指数级相关的。空间转录组的数据分析虽然还没有达到时空序列分析的复杂度,但是空间参数的引入也必然会使得整个分析内存消耗大幅增加,这也使得以个人计算机做数据分析的可能性降低。

    空间转录组的实验难点更多地来源于其高度的个性化,基迪奥的专业个性化服务也将继续为空间转录组项目提供支持。

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    参考文献:

    [1]GiacomelloS., Salmén F.,Terebieniec B.K. and et al. Spatially resolved transcriptome profiling in modelplant species. Nat Plants, 2017. 3:17061.
    [2]GiacomelloS. & Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomicsprofiling using barcoded microarrays. Nat Protoc, 2018. 13(11):2425-2446.


    本文作者:基迪奥-L.L

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    发表于 2020.1.10 10:53:09 | 显示全部楼层
    这是在为年写基金发福利吗3
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  • TA的每日心情
    好棒
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    发表于 2020.1.21 11:00:49 | 显示全部楼层
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    happy!
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    发表于 2020.3.13 09:58:32 | 显示全部楼层
    好文,学到了
    我说今晚月光那么美,你说不是的
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