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基迪奥客户文章——少量样本的10X转录组研究思路分享

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    发表于 2019.10.14 17:57:56 | 显示全部楼层 |阅读模式
    10X单细胞转录组推出至今已三年有余,使用该技术发表的文献已有460余篇;基迪奥开展10X业务以来,一年时间已经有多篇10X客户文章投稿甚至发表;可见,10X转录组是当今生命科学研究领域的当红技术。

    然而,10X转录组的样本单价使得该技术在很多老师的眼中仍是一项需要大量资金投入的项目,尤其是发表在NCS上的单细胞文章动辄10-20个样本的研究思路,令部分老师对这一技术望而却步。

    如今的10X单细胞转录组已经逐渐脱离了稚嫩期,越发地看重后续的基因功能验证。在这种趋势下,简单的样本数据堆积已不再是一篇合格的10X单细胞文章。

    天津医科大学刘志勇老师实验组为我们提供了一个可行的思路,在顺应如今10X单细胞研究的大趋势下,依靠少量样本的单细胞测序结合合理的细胞分子实验完成了一篇不错的文章,于今年10月1日发表在《Oncogene》上。

    这篇文章以多发性骨髓瘤为研究对象,从4个样本的单细胞测序入手,挖掘与抗药性有关的基因和信号通路,再结合合理的细胞实验、分子实验、临床验证,完成了一篇6+分的文章,可以说是高性价比了。今天,我们将带领大家一起研读这篇文章的研究过程,为广大客户提供一个性价比较高的10X 单细胞研究思路。



    合作单位:天津医科大学
    发表期刊:Oncogene
    影响因子:6.634

    研究背景

    多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是世界上排名第二的因骨髓中终末分化浆细胞单克隆增殖引起的血液病,大多数病人会因为单克隆免疫球蛋白堆积而产生溶骨性病变。如硼替佐米等蛋白酶抑制剂类药物的使用大大延长了病人的生存时间。但是,伴随着这类治疗方案的普及,临床上开始出现肿瘤抗药性,导致复发的肿瘤缺乏合适的治疗方案。所以,对于蛋白酶抑制剂类的药物抗性机制研究一直受到广泛的关注。

    研究材料

    (1)取无抗药性的骨髓瘤细胞系和有抗药性的骨髓瘤细胞系分别制备单细胞悬液,进行10X单细胞测序,两个生物学重复。

    (2)收集健康人、初诊为骨髓瘤的病人和复发骨髓瘤的病人的外周血,磁珠分选CD138+浆细胞用于临床分子实验验证。

    (3)利用MM.1S和OPM-2两个细胞系构建基因编辑细胞系,用于分子实验验证。

    研究思路


    图1 文章研究思路

    结果解读

    1、hedgehog信号通路在MM抗药性中发挥重要作用

    作者通过药物诱导的方式建立了两个抗硼替佐米抗性(bortezomib resistance, BR)MM细胞系MM.1S和OPM-2。作者首先进行传统转录组测序,得到了286个上调基因和75个下调基因,对差异基因进行KEGG富集分析,差异基因富集至细胞粘附、hedgehog(Hh)信号通路和造血细胞系等通路上。

    作者又使用无抗性的MM和MM.1S两个细胞系进行了10X单细胞转录组测序。作者将两个样本的细胞分为了7个细胞亚群,其中cluster2、5、6主要来源于无抗性的MM,cluster0、1、3、4主要来源于抗性细胞系MM.1S(图2A)。

    经过对各细胞亚群的上调基因分析,作者发现Hh信号通路下游的GLI1、PTCH1、MYC和CCND1在cluster0、1、3、4中都显著上调(图2B)。同时,传统转录组的热图也显示Hh信号通路的下游信号分子在两个抗性细胞系中都相对于无抗性细胞系上调(图2C)。

    结合两个转录组的测序结果,可以看出Hh信号通路在MM的抗药性机制中发挥着重要的作用。


    图2 A) 10X单细胞测序tSNE降维图;B) 四个基因在不同细胞亚群表达量情况的小提琴图;C) 传统转录组测序差异基因热图。

    2、SIRT1作为Hh信号直接下游分子引起了MM抗药性

    通过转录组的热图可以看出,SIRT1是Hh信号通路下游分子中上调最显著的,所以作者设计了三步实验去确认并探究SIRT1在MM抗药性中发挥的分子机制:

    (1)验证SIRT1表达量伴随细胞系抗药性变化

    作者为了验证SIRT1与细胞抗药性的关系,检测了不同状态下细胞的SIRT1表达水平。通过免疫蛋白印迹(western blotting, WB)可以看出,在MM.1S和OPM-2两个细胞系经过硼替佐米刺激后,其SIRT1的表达量显著上升(图3A),同时,SIRT1在CD138+ 浆细胞中的表达量呈现复发患者显著高于新诊断患者、新诊断患者显著高于正常人的状态(图3B)。

    为了进一步验证SIRT1在MM抗药性中发挥的作用,作者选取了八个IC50不同的细胞系检测其SIRT1表达量,发现SIRT1表达量高的细胞系其对硼替佐米的IC50越高(图3C)。如此,作者证明了SIRT1与骨髓瘤抗药性有显著关联,可以进行进一步的分子机理探究。


    图3 A) 在硼替佐米刺激下,MM.1S和OPM-2细胞系SIRT1的表达量变化;B) 健康人(PC)、初诊骨髓瘤病人(pMM)和复发骨髓瘤病人(rMM)CD138+浆细胞SIRT1的表达量变化;C) 不同MM的IC50和SIRT1表达量水平。

    (2)探究SIRT1的相互作用分子

    在确定了SIRT1与细胞抗药性的相关性后,便需要探究SIRT1引起细胞抗药性的分子机制,而SIRT1的相互作用分子是一个很可观的切入点。作者利用免疫共沉淀(IP)和质谱检测出了一个与SIRT1相互作用的分子——GLI2。同时,通过过表达SIRT1(SIRT1-OE)、敲除SIRT1(SIRT1-KD)、使用SIRT1激活剂(SRT1720)和使用SIRT1抑制剂(EX527)四个途径证明SIRT1影响GLI2的转录活性(图4A)。

    那么,SIRT1是如何影响GLI2的转录活性的呢?

    作者从两个方向入手:①GLI2是转录因子,也是Hh信号通路的重要调节分子,所以作者检测了SRIT1对GLI2入核效率的影响;②GLI2作为转录因子,半衰期较短,所以作者检测了SRIT1对GLI2讲解速率的影响。

    通过免疫荧光实验,我们可以看到,在正常的细胞当中,GLI2是同时分布于细胞核和细胞质的,但是,当过表达SIRT1后,GLI2在核中的信号远高于细胞质,GLI2的入核效率提高了;当敲除SIRT1后,GLI2无法完成入核(图4B)。WB实验得到同样的结果。这一结果说明SIRT1发挥引导GLI2入核的功能。

    在过表达或敲除SIRT1后,作者对细胞使用放线菌酮(CHX)抑制细胞蛋白质合成,检测GLI2的降解速率。通过WB实验检测不同时间点GLI2的蛋白总量,发现在过表达SIRT1细胞中,GLI2降解速率变慢;在敲除SIRT1细胞中,GLI2降解速率变慢(图4C)。这一结果说明SIRT1可以保护GLI2,减慢GLI2的降解速率。

    作者后续设计了IP实验和缺失突变体实验、点突变实验验证SIRT1是通过去乙酰化激活GLI2,通过去泛素化作用防止GLI2被降解。

    经过以上一系列实验,可以得到如下结果:SIRT1可以提高GLI2的表达水平、如何效率,并降低了GLI2降解速率,借此,SIRT1完成了对Hh信号通路的持续激活状态,影响了细胞的耐药性。


    图4 A) 过表达或敲除SIRT1后GLI2的表达量变化;B) 过表达或敲除SIRT1后GLI2信号在细胞内分布情况;C) 过表达或敲除SIRT1后GLI2蛋白的降解速率。

    (3)SIRT1作为Hh信号通路的下游分子作用

    在以上实验中,作者已经验证了SIRT1调节Hh信号通路的功能;但在广泛认知中,SIRT1是Hh信号的靶向分子,那么,SIRT1的表达量又是否收到Hh信号通路的调节呢?基于GLI2对Hh信号的调节作用,作者构建了GLI2的瞬时表达质粒,伴随着转染的表达质粒的增多,SIRT1的蛋白水平也在逐步提高(图5A);此外,利用Shh-N激活Hh信号后,SIRT1的蛋白水平也同步增加(图5B);染色质共沉淀实验也验证GLI2蛋白可以特异性结合SIRT1启动子区域,调控SIRT1的表达(图5C)。如此,作者构建了一套SIRT1-GLI2-Hh信号通路介导的SIRT1正反馈调节系统。


    图5 A) SIRT1伴随GLI2表达量增加的蛋白水平变化;B) Shh-N刺激浓度增加后SIRT1的蛋白水平变化;C) GLI2对SIRT1基因的DNA片段富集程度。

    3、动物实验验证SIRT1对MM抗药性的影响

    基于以上三步的分子验证,作者证明了基于SIRT1蛋白的Hh信号通路系统在MM抗药性发生过程中的重要作用。但是对于肿瘤学来说,体内环境和细胞培养环境存在一定的差异,体外实验不足以完全证明某些分子的重要性。

    所以,作者采用荷瘤实验,使用硼替佐米和SIRT1抑制剂的协同给药,观察小鼠病程。在协同给药后,无论是肿瘤的体积(图6A)还是小鼠溶骨现象(图6B)都得到了显著的缓解。这说明靶向SIRT1的药物控制使得MM的抗药性降低。

    另外,对病人的CD138+浆细胞的SIRT1检测,可以发现完全恢复的病人的SIRT1水平明显偏低(图6C)。如此,文章的实验结果得到临床数据的肯定,整篇文章的结构趋于完善。


    图6 A) 不同给药组肿瘤体积变化;B) 不同给药组溶骨情况比较;C) 不同恢复情况病人CD138+浆细胞SIRT1表达水平。

    总结

    本文是一篇典型的“干湿结合”的文章,以10X单细胞转录组入手寻找关键基因,再针对关键基因及相关信号通路设计分子实验和临床验证,完成了组学-细胞实验-临床验证的完整套路,证明了SIRT1-GLI2-Hh信号通路介导的细胞抗药性发生途径,开发了硼替佐米-SIRT1抑制剂联合用药治愈多发性骨髓瘤的潜在可能性。

    从这篇文章我们可以总结出以下四点经验:

    (1)细胞分子实验是现今生物学的重心。组学是简化生物学研究的重要方式。这也是基迪奥一直强调的“干湿结合”的研究思路,通过组学揭示关键基因,指导细胞分子实验的研究方向;最终还是要在细胞分子实验中去验证组学结果,才能完成一篇优秀的文章。

    (2)10X单细胞转录组本质还是转录组。10X单细胞转录组挖掘细胞异质性的新功能特性使得很多老师深陷其中,反而忽视了其转录组本质,样本之间的差异性研究依然是单细胞转录组中不可或缺的分析内容。

    (3)10X单细胞转录组已经脱离了早期发展的稚嫩期,单纯的组学分析已经不能满足文章发表需求。也正是在这样的大背景下,小量样本的单细胞转录组测序配合合理的细胞分子实验会是发表6-8分文章的高性价比选择。

    (4)10X单细胞转录组的数据挖掘更加精细了。愈加精细的数据挖掘伴随着更多的数据分析内容,对老师的生信分析技术要求也就越高。

    基迪奥的测序分析服务是老师们完成数据分析的好帮手,基迪奥的项目经验会为老师节省大量的生信分析时间,需要做10X单细胞测序的老师可以联系我们开展相关项目。
    如今,面对愈加精细的数据挖掘产生的大量个性分析,基迪奥也推出了10X单细胞转录组在线分析平台(www.omicsmart.com),让数据挖掘更加简单。

    参考文献

    Xie Y, Liu J, Jiang H and et al. Proteasome inhibitor induced SIRT1 deacetylates GLI2 to enhance hedgehog signaling activity and drug resistance in multiple myeloma.Oncogene, 2019, doi: 10.1038/s41388-019-1037-6.

    本文作者:基迪奥L.L

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