查看: 13399|回复: 21

[ChIP-seq] 给大家分享一下ChIp实验的心得体会~~

  [复制链接]

帝王蝶

Rank: 4

主题
13
注册时间
2015.11.23
在线时间
31 小时

发表于 2015.12.9 10:12:21 | 显示全部楼层 |阅读模式
最近发现很多人在实验设计的时候脑子短路了,然后就没有然后了……我一直秉着为大家排忧解难的宗旨,今天特别跟大家分享这篇ChIP项目的心得体会,希望对大家有帮助~

染色质免疫沉淀(ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。虽然ChIP技术的原理不复杂,但是对技术的要求高,实验步骤的设计摸索耗时耗力,实验耗费时间长。
要成功实施ChIP项目,请明确下面4个问题~

1、是否需要交联
交联的目的是将感兴趣的抗原固定在其染色质结合位点。如果没有交联的步骤,就意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀,譬如组蛋白。如果您的研究对象是组蛋白,那可能不需要交联,而其他蛋白,如转录因子和DNA结合复合物中包含的蛋白,可能还需要交联。

如果使用交联,那么ChIP反应被称为X-ChIP,如果是天然的ChIP反应被称为N-ChIP。然而,确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式,因为在交联过程中它们的表型会发生变化,或出现包涵体。



2、片段化要小心
染色质必须片段化,才能让相互反应接触到抗体。无论您采用哪种方法,都必须确保一定的片段化时间进程。对于X-ChIP,超声波处理是必需的,因为甲醛交联限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化,不过说明书上通常都会给出一个参考条件。超声波产生了随机的DNA片段(平均500-700 bp)。在开展N-ChIP时,微球菌核酸酶的消化可产生~175 bp的单体。酶切消化的优势在于消化的重复性好,易控制反应。

3、抗体用对没有
如果可以的话,使用经过充分验证、ChIP级别的抗体。当然,这种抗体并不多。如果没有,也可以选择普通的免疫沉淀抗体,或能够识别天然表位的抗体。一般来说,多克隆抗体是个更好的选择,因为单克隆抗体只识别单个表位,而这个表位有可能在交联过程中被掩盖。而另一方面,单克隆抗体却往往有着更好的批间一致性。抗体的量和使用的条件都应根据使用经验来确定。一般情况下可以从每50ug DNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。


4、对照也很重要
作为ChIP技术的阳性对照,H3K4me3和H3K9me3分别适用于激活和失活的基因。作为阴性对照,可选择一个识别非染色质表位的抗体,如GFP抗体。但要记住,这些抗体本身不是阳性和阴性对照,因为这取决于您正在研究的位点。如果在您研究的位点无H3K4me3,即使是最好的ChIP级别的H3K4me3抗体也不能让任何东西免疫沉淀,那么这就不是一个理想的阳性对照。如果您的实验室刚刚开始用ChIP,最好考虑购买试剂盒。
(转自生物通)


大家有什么实验体会也一起交流一下。




本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x

评分

参与人数 1奥币 +5 贡献 +2 收起 理由
小瑶 + 5 + 2 很给力!

查看全部评分

回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
7
注册时间
2015.11.24
在线时间
15 小时

发表于 2015.12.9 10:36:32 | 显示全部楼层
手动点赞
回复

使用道具 举报

管理员

Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

主题
49
注册时间
2015.12.5
在线时间
539 小时

活跃会员论坛元老


发表于 2015.12.9 14:08:13 | 显示全部楼层
必须点赞!
新的一天加油!
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
17
注册时间
2015.12.7
在线时间
145 小时

优秀版主


发表于 2015.12.12 10:28:23 | 显示全部楼层
虽然我不做实验了,但也必须点赞!想起以前读书时被实验虐的啊~~~~
回复 支持 反对

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2015.12.17
在线时间
2 小时

发表于 2015.12.25 17:38:11 | 显示全部楼层
美滋滋的,好受教
回复 支持 反对

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
2
注册时间
2015.12.7
在线时间
16 小时

发表于 2015.12.25 18:14:23 | 显示全部楼层
楼主你介绍了阳性对照,能介绍下阴性对照和Input对照吗?
回复 支持 反对

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
7
注册时间
2015.12.29
在线时间
24 小时

突出贡献论坛元老


发表于 2016.1.19 20:20:15 | 显示全部楼层
大哥,我自己手动配试剂都做出来了,只是抗体的级别高点,最好把实验过程放在上面
回复 支持 反对

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
13
注册时间
2015.11.23
在线时间
31 小时

 楼主| 发表于 2016.1.20 09:11:37 | 显示全部楼层
taojun7054602 发表于 2016.1.19 20:20
大哥,我自己手动配试剂都做出来了,只是抗体的级别高点,最好把实验过程放在上面 ...

@基迪奥小师妹
回复 支持 反对

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
17
注册时间
2015.12.7
在线时间
145 小时

优秀版主


发表于 2016.1.20 18:00:10 | 显示全部楼层

没做过chip实验……
回复 支持 反对

使用道具 举报

功夫熊猫

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
1
注册时间
2016.4.25
在线时间
797 小时

灌水之王


发表于 2016.5.2 13:45:00 来自手机 | 显示全部楼层
学习,点赞
回复

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
0
注册时间
2016.5.30
在线时间
3 小时

发表于 2016.5.31 08:26:36 | 显示全部楼层
谢谢分享
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
0
注册时间
2016.3.16
在线时间
246 小时

发表于 2016.6.6 10:22:12 | 显示全部楼层
好心人呀
回复

使用道具 举报

迅猛龙

Rank: 8Rank: 8

主题
7
注册时间
2016.4.8
在线时间
392 小时

最佳新人


发表于 2016.6.29 09:38:55 | 显示全部楼层
签到
回复

使用道具 举报

版主

Rank: 10Rank: 10Rank: 10

主题
52
注册时间
2016.1.8
在线时间
274 小时

突出贡献优秀版主论坛元老


发表于 2016.7.31 17:07:25 | 显示全部楼层
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
14
注册时间
2016.5.6
在线时间
34 小时

发表于 2016.9.8 18:06:08 | 显示全部楼层
{:8_414:}
gcfc 城管局
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
7
注册时间
2016.9.5
在线时间
67 小时

发表于 2016.9.21 17:45:06 | 显示全部楼层
学习,点赞
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
39
注册时间
2016.5.12
在线时间
128 小时

活跃会员


发表于 2016.12.29 14:18:22 | 显示全部楼层
我想知道Chip 的试剂盒由什么东西,由什么好处?
回复 支持 反对

使用道具 举报

草履虫

Rank: 2

主题
0
注册时间
2017.1.5
在线时间
1 小时

发表于 2017.1.5 13:22:50 | 显示全部楼层
Great
回复

使用道具 举报

帝王蝶

Rank: 4

主题
7
注册时间
2016.9.5
在线时间
67 小时

发表于 2017.2.3 03:10:12 | 显示全部楼层
50ug DNA 好多,是必须经过纯化吗?楼主有没有从直接从细胞或组织开始经验?
回复 支持 反对

使用道具 举报

钵水母

Rank: 3Rank: 3

主题
1
注册时间
2016.3.20
在线时间
5 小时

发表于 2017.5.15 12:58:55 | 显示全部楼层
对照有没有试过Mock ?
****
回复 支持 反对

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表