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[转录组] 10X单细胞定制分析——细胞分化轨迹分析(上)

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    发表于 2019.7.10 09:23:46 | 显示全部楼层 |阅读模式
    上周的文章中,我们介绍了10X genomics ScRNA-seq常见的定制化分析(详情戳这里)。今天的文章,继续10X单细胞定制分析的内容。

    细胞分化研究的两类方法——分子实验技术和生信技术

    传统分子实验技术

    以上介绍的10X单细胞分析,本质上都是分类,包括对细胞进行分类(细胞区分亚群)和基因分类(各个亚群上调/下调表达的基因)。但仅仅分类还是不够的,对于各类细胞,我们可能会关心它们之间的潜在演化/分化先后关系。

    另外还有非常重要的一点,在传统的观点中,认为只有干细胞/祖细胞才具有全能性,已经分化的细胞将不再具有可塑性。但今年来的研究表明,哪怕是已经分化的细胞,在特定条件下也能恢复可塑性。

    比如在损伤和修复的条件下,成熟肾细胞可以去分化从而重新具有可塑性[1]。在损伤导致胰岛素B细胞大量损失的情况下,胰岛素A细胞则可以转化为B细胞进行补充[2]。因此,哪怕是成年个体稳定的组织,依然有研究细胞分化关系的潜在需求。

    在传统研究策略中,为了研究细胞的演化过程最常见的是使用遗传标记法。例如在祖细胞中通过转基因的策略引入遗传标记,然后观察祖细胞在后续过程中如何分化。这类研究策略被称为细胞系谱追踪(lineage tracing)。基于各种策略,目前对主要组织(例如,小脑)已经有了基本的细胞分类图谱。

    但传统的细胞系谱追踪有以下不足:(1)实验复杂,因此效率比较低。(2)但传统研究中,通常可用的基因标记是有限的,所以细胞分类可能比较粗糙。
    (3)一些中间状态细胞(位于两个稳定状态之间的过渡细胞类型)往往稀有(转瞬即逝,从而比例低),采用传统的方法可能难以观察并获取。
    (4)对后代细胞分类后,还无法直接获得解析分化过程中的关键差异基因。

    生信技术的出现

    10X单细胞转录组测序这样的高通量单细胞检测技术出现,使得基于大规模转录组数据推算细胞之间的演化/分化过程成为可能。基于转录组数据,是利用模型预测细胞演化/分化过程,这样的研究策略一般称为细胞分化轨迹(differentiation trajectories)分析或轨迹推断(trajectories inference)。
    相比基于分子实验技术的细胞谱系追踪,基于基因大数据的细胞分化轨迹分析的优势在于:

    (1)实验相对简单
    (2)一次获得上千基因标记,从而可以对细胞进行精细区分
    (3)记录样本中一瞬间成千上万个细胞的信息,保证稀有/短暂存在的细胞类型也可能被捕获。
    例如通过大规模单细胞测序发现[3],在肾集尿管中的闰细胞(intercalated cells,图1的亚群6)和主细胞(principal cells,图1的亚群7)可以去分化并相互转化。
    且两类细胞中,还存在一种转化中间状态的细胞类型(图1的亚群8)。该细胞较为稀有,仅占全部细胞的0.25%,之前尚未被报道。如果没有高通量的检测技术,这样短暂存在的稀有细胞可能就会被忽略。


    图1 闰细胞和主细胞可以相互转化,且存在一种稀有的中间型细胞

    (4)基于基因大数据,直接获得驱动细胞亚群分化相关的关键基因。

    两类技术的互补性

    当然,并不是说细胞轨迹分析要取代传统的细胞谱系追踪,两者应该是相辅相成,相互促进:
    a)已有的谱系追踪的结果为细胞分化轨迹分析提供了基础
    细胞分化轨迹分析,并非把所有细胞都一股脑扔到软件中,而是需要预挑选潜在存在分化关系的细胞类型(下文会介绍)。因此,已有的细胞谱系追踪结果,很多情况下就是细胞分化轨迹分析的细胞亚群挑选提供了依据。

    b)细胞分化轨迹分析可以用于发现没有被报道的细胞分化关系,系谱分析可以用于验证这些新的发现。
    细胞间的分化关系并非一层不变的。例如,随着研究不断深入,不断有报道表明成熟分化后细胞可以通过去分化获得可塑性,进而分化为其他类型的细胞。这些没有被系谱分析发现的新的分化关系(建立假设),则可以用细胞分化轨迹分析去模拟预测(大数据模拟)。
    数据分析模拟毕竟代表一种概率上的可能性,要成为“实锤”,文章上档次,则离不开分子水平的验证。这个时候,则可以用细胞谱系追踪技术去验证数据模拟的结果(分子验证)。这种建立假设→大数据模拟→分子验证的策略,是组学数据分析的经典套路,在10X单细胞数据解析中依然适用。
    比如肾组织研究中,通过分化轨迹分析推断闰细胞和主细胞可以去分化后相互转化,作者也使用了传统的基于标记基因的细胞谱系追踪法验证了新的发现,这是这篇Science文章最大的两点之一[3]。

    从瞬间快照窥视细胞的一生

    10X转录组一次检测样本数千个细胞还获得了一个优势:一个组织样本中往往同时含有处于不同分化阶段的同类细胞,从而让我们不需要密集多时间采样也能构建该类细胞分化过程的图谱。
    类似图2(a)是樱桃小丸子一家的聚餐合照。因为他们是直系亲属,因此我们可以直接基于这个瞬间的画面,来构建这个家族的个体在儿童、成年以及老年变化过程中的外貌特征演变图谱,而不需要去静静等待小丸子慢慢长大成年。
    当然,哪怕同个家族的个体间还存在很大的差异性。但对于细胞来说,其遵循的分化过程则更稳定保守。例如,图2(b)是某个体某个时期,基于10X转录组获得血液细胞分类快照。其中包含了三个未成熟的红细胞亚群(IE1、IE2、IE3)和一个成熟的红细胞亚群(ME)。
    基于细胞分化轨迹分析,我们就可以预测最可能分化路径是IE1→IE2→IE3→ME。这个分化路径,本身包含了时间信息——随着时间变化红细胞可能会如何一步步变化。这样的一个分析结果,好像是我们已经观察了某个细胞的一生一样。
    但实际上,这些结果只是我们通过某个组织一瞬间的群体单细胞数据推导得到的。因此,细胞分化轨迹分析的结果又常常被称为拟(伪)时间(Pseudotime)分析。


    图2  无论家庭快照(a)还是细胞快照(b)都可以帮助我们构建一个群体中个体的潜在演化过程。



    细胞分化轨迹分析背后的逻辑

    细胞分化轨迹分析,实际上非常类似进化树。如果有几千个细胞的转录组数据,那么利用这些数据,是可以构建各个细胞的关系树(图3.a)。在这个树中,每个细胞占据一个枝条,枝条的末端就是一个细胞。从树中,我们就可以看出细胞间的聚类关系。

    这个部分的内容,我们在测序的结题报告中,一般都可以见到。但这个树对于推断细胞的演化关系还是太复杂了。所以,细胞分化轨迹分析算法本质是对复杂冗余的树结构进行修剪(简化),保留树中最重要的主干结构。

    细胞被从各个“枝条”修剪下来后,被重新“贴到”最临近的树干上。这个过程被称为细胞映射(Project)到树结构中。从最终的树结构中,我们就可以了解细胞群体间的演化关系。

    如图3.b,我们可以观察到细胞的演化过程:从树结构上看,从1位置的亚群演化到2位置,然后在这个位置分化为两个分支,分别演化为3亚群和4亚群。



    图3 传统的关系树(a)以及细胞拟时间分析结果示意图(b)

    细胞分化轨迹分析的应用情境
    细胞分化轨迹分析期望达到两个目标:
    1)推导若干个可能存在分化/演化继承关系的细胞亚群间最可能的分化路径
    2)找出驱动细胞亚群分化的关键基因

    因此该分析的应用情境必须基于两点:
    1)对目标细胞亚群已经有清晰的鉴定和划分
    2)我们预期其中若干细胞亚群存在谱系上的分化继承关系,并期望通过分析确定它们的分化过程。 那么,细胞分化轨迹分析的步骤和注意事项有哪些呢?等我们下期讲解。


    拓展阅读

    10X单细胞RNA-seq基础分析步骤与常见图形解析(下)10X单细胞RNA-seq基础分析步骤与常见图形解析(上)为什么要做单细胞测序10X genomics ScRNA-seq定制分析
    参考文献
    [1] Chang-Panesso M, Humphreys B D. Cellularplasticity in kidney injury and repair[J]. Nature Reviews Nephrology, 2017,13(1): 39.
    [2] Thorel F, Népote V, Avril I, et al.Conversion of adult pancreatic α-cells to β-cells after extreme β-cell loss[J].Nature, 2010, 464(7292): 1149.
    [3] Park J, Shrestha R, Qiu C, et al.Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellulartargets of kidney disease[J]. Science, 2018, 360(6390): 758-763.

    本文作者:周老师


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