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[转录组] 利用翻译组技术进行基因水平和密码子水平的定量

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    发表于 2019.5.20 13:16:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
    Riboseq数据的基本特性
    Ribosome profiling sequencing(Ribo-seq) 是针对核糖体结合的RNA进行测序。其测序结果有几个特点:
    1. 从来源区域和定量方式上,非常类似RNA-seq的结果;
    2. 由于核糖体与mRNA结合并引导翻译,所以Ribo-seq数据又有其自己独特的特性;
    简要解释一下第一点。翻译组技术(无论是Ribo-seq还是RNC-seq)都是先富集与核糖体结合的正在翻译的RNA,然后通过测序对富集的RNA进行定量,从而实现对翻译强度进行定量。所以,翻译组技术可以认为是“升级”版的RNA-seq。翻译组对基因翻译的定量,也是以RPKM的方式呈现,差异翻译分析与RNA-seq也基本相同。
    但Ribo-seq的精度已经足以检测正在翻译的mRNA片段,片段长度大概30nt,又被称为核糖体足迹(Ribosome footprints,简称RFs)。一条RFs对应1个结合在该基因上的核糖体。相比RNA-seq测序结果是随机片段,RFs数据又有自己独特的特性(图1)。


    图1  一张图足以说明Ribo-seq数据的特性

    Ribo-seq数据的特性,主要在基因内部来呈现的,总体说来有三点(如图1):

    1. 落在基因区的RFs大部分集中CDS区,5‘UTR区和3’UTR区数据极少(图1a)。因为核糖体主要在编码区滑动,而较少进入UTR区,尤其3’UTR区。因为大部分核糖体遇到终止密码子后,会从mRNA上脱落。
    2. RFs在CDS区的深度分布,呈现明显的“高-低-低”三碱基周期模式(图1b、c)。因为核糖体在mRNA上快速滑动,每滑动1个密码子(3个碱基),则要停顿下来。然后等待tRNA将对应的氨基酸转运过来,并将新转运的氨基酸连接到结合在核糖体P位点(图1c中核糖体的字母P的位置)的肽段上,将肽段延伸一个氨基酸。
    即,核糖体是每隔三个碱基停顿一次,而加入翻译抑制剂(放线菌酮)或液氮速冻后,核糖体在mRNA上的滑动会瞬间停止。那么,大部分核糖体的在mRNA上的足迹位置(最后停留的位置),就是3的整倍数。因此,正确的RFs信号在CDS上应该呈现三碱基周期。而普通的RNA-seq的reads,在编码基因上则是随机分布的。
    注意:加入翻译抑制剂(放线菌酮)后,核糖体P位点对应的mRNA上的密码子,就是最后一个延伸的氨基酸。从而,我们可以从RFs序列,判断对应的核糖体正在翻译哪个氨基酸。

    基于RFs的翻译定量

    由于RFs以上特性,RFs可以用于不同层面的翻译相关的科学问题。
    ▶ 基因水平的翻译定量由于一条RFs对应1个结合在该基因上的核糖体。因此,统计一个基因内的RFs条数(就是Ribo-seq的reads数),就代表该基因的翻译丰度。其定方式与RNA-seq类似,一般用RPKM值。由此,翻译组的数据非常方便与转录组(翻译组的上游)或者蛋白组(翻译组的下游)进行关联分析,讨论翻译与中心法则其他位置调控的关系。(这点我们后续文章会重点介绍)
    ▶ 密码子水平的定量由于一条RFs对应1个结合在该基因上的核糖体。我们可以从RFs的位置推断每个核糖体翻译到了基因的哪个位置,正在翻译哪个氨基酸。当统计大量RFs的位置信息,则主要可以用于回答两个问题:
    1. 在基因内部,分析基因不同位置的翻译速度快慢发育不同阶段、逆境胁迫、遗传背景差异等不同条件下,基因翻译不同阶段(起始、延伸和终止)可能会受到影响。从基因内部密码子水平上观察翻译的速度,有助于细致解释翻译调控的机制。
    例如,下图两篇文章,都是发现在应急条件下,样本的在翻译起始位点附近出现RFs信号上升。这说明核糖体在这些地方出现了阻滞,抑制了翻译延伸,从而导致相关基因的翻译量降低。而图2左图的研究,最终表明是由于热休克蛋白Hsp70从核糖体脱落,导致了翻译速率的降低。


    图2  Ribo-seq时间解析逆境胁迫下基因内部的翻译速率变化

    2. 分析61种密码子的翻译速度快慢密码子的翻译速度主要由tRNA决定的。如果某个密码子对应的tRNA在细胞内浓度不足,那么核糖体需要在对应mRNA密码子上长时间停留,等待tRNA转运对应氨基酸过来。因为每一条RFs可以对应一个正在翻译的密码子。
    从RFs就可以推导细胞在一瞬间61种密码子的翻译量,进而推导各种密码子的翻译速度是高于平均值还是低于平均值。通常,翻译速度低于平均值的密码子是由于对应的tRNA不足导致,从而可以从另外一个角度了解翻译调控现象。


    图3  两种条件下各个密码子翻译速度与期望值的差异(PNAS,109(43), 17394-17399.)

    ▶ 非编码RNA的翻译还有一点,除了我们熟知的编码基因之外,近年来不断有研究表明,一些传统意义上的非编码区域或非编码RNA(包括编码基因的UTR区,lncRNA,环状RNA等)也是可以翻译多肽/蛋白质的。由于Ribo-seq数据可以检测核糖体在被翻译的RNA上瞬间足迹,因此Ribo-seq数据几乎也是用于大规模挖掘可以翻译非编码RNA最强武器。在后续文章中,我们将解释Ribo-seq应用在这个领域的基本原理。

    翻译组技术相关文章回顾

    我们都熟知转录组,却可能忽略了翻译调控
    翻译组技术到底是什么?为什么能发高分文章?

    Tips:对翻译组测序感兴趣的老师和同学可留言咨询,基迪奥会为您量身定制专业的个性化实验分析方案。

    本文作者:周老师
                   

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